牛卵母細胞冷凍的實驗研究

牛卵母細胞冷凍的實驗研究

目前，牛仔細胞的成熟育種技術(shù)已經(jīng)取得了很大的成功，但卵母細胞的冷凍過程非常有限，主要集中在成熟的卵母細胞的冷凍方面。牛成熟卵母細胞的冷凍存在一些缺陷,如成熟卵母細胞的透明帶在冷凍后變硬、紡錘體解體以及冷凍導(dǎo)致的卵母細胞的激活。而牛卵泡卵母細胞的冷凍可以克服這些缺陷。雖然在目前的研究水平上,牛卵泡卵母細胞的冷凍效果不如成熟卵母細胞的冷凍效果,但是隨著冷凍生物學的發(fā)展和對牛卵泡卵母細胞冷凍的重視,牛卵泡卵母細胞的冷凍將取得更大的進展。本試驗在簡化牛卵母細胞體外成熟的基礎(chǔ)上,觀察了保護劑、平衡溫度、預(yù)平衡方法、解凍方法以及冷凍方法對牛卵泡卵母細胞冷凍的影響,旨在探索出一條較理想的牛卵泡卵母細胞冷凍保存方法。1材料和方法1.1溶液的制備1.1.1液體成熟M199+26.2mmol/LNaHCO3+10mg/LFSH+20mg/LHCG+2mg/LE2。1.1.2平衡液gly/gly(1)基礎(chǔ)液DPBS+20%FCS;(2)平衡液3.3%GLY(EG)、6.6%GLY(EG);(3)冷凍液10.0%GLY(EG)+0.1mol/LSucrose。1.1.3預(yù)平衡液2eg(1)基礎(chǔ)液DPBS+20%FCS;(2)預(yù)平衡液5%EG、20%EG;(3)玻璃化冷凍液40%EG+0.5mol/LSucrose。1.1.4解凍液0.5mol/lmool/lmocrose、0.33mool/lmocrose、0.33mool/lmocrose的計算(1)基礎(chǔ)液DPBS+20%FCS;(2)解凍液0.5mol/LSucrose、0.33mol/LSucrose、0.17mol/LSucrose。1.2卵母細胞的分離培養(yǎng)將屠宰場摘取的卵巢放入35～38.5℃的生理鹽水中帶回實驗室。用帶有12#針頭的5mL注射器抽吸2～8mm卵泡中的卵母細胞,在實體顯微鏡下選擇帶有完整致密卵丘顆粒細胞的卵母細胞復(fù)合體(COCs),用DPBS+5%FCS溶液洗3遍。如若培養(yǎng),則用NaHCO3-bufferedTCM199液洗4遍后,移入成熟培養(yǎng)液;否則做冷凍處理。1.3母細胞的冷凍和解凍1.3.1回用麥管裝管制備預(yù)平衡液將室溫調(diào)至25～27℃,使試驗用具及試劑得到充分平衡。首先將卵母細胞在38.5℃的5%～10%的第1預(yù)平衡液中平衡10min,再將卵母細胞轉(zhuǎn)入室溫下的20μL的第2預(yù)平衡液中停留30s至1min,然后轉(zhuǎn)入38.5℃(加熱板)/25℃/4℃(冰袋在4℃冰箱中充分平衡)下的20μL的玻璃化冷凍液中分別平衡30～40s,用帶有1mL塑料注射針筒的麥管裝管,保存1周。解凍時,從液氮中取出麥管,在空氣中平衡5s,然后在38.5℃的水浴10s后,將卵母細胞依次在0.5、0.33、0.17mol/L的解凍液中分別平衡5min,在含20%NCS的DPBS液中洗滌2遍(各5min),然后在成熟培養(yǎng)液中漂洗4遍,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)小滴中培養(yǎng)。1.3.2小樣品玻璃mss的冷凍和解凍(1)細口毛細玻璃管的制作將外徑為1mm、內(nèi)徑為0.8mm的毛細玻璃管泡酸、洗滌、烘干、酒精消毒后,晾干備用。細口毛細玻璃管的制作(圖1):將毛細玻璃管的中部在酒精燈下拉長,使其中心部分的外徑由1mm變?yōu)?.3mm,再用砂輪從中間切斷,然后在自制的小酒精燈下拋光管口即可。如果吸進液體有10mm長,以4/3πr3×10計算細端體積約為0.14μL。(2)抗凍劑的制備先將室溫預(yù)調(diào)整到25～27℃,使卵母細胞在預(yù)處理液5%EG中平衡10min,然后移入5μL玻璃化液中,暴露在玻璃化液中的時間控制在30s以內(nèi)。通過毛細管現(xiàn)象將卵母細胞、少量玻璃化液和氣泡吸入毛細玻璃管,保證吸入的玻璃化液為1～2μL,卵母細胞4～5個,隨后投入液氮冷凍保存。從液氮中取出GMP管,將帶有卵母細胞的一端浸入37℃含0.5mol/L蔗糖的解凍液中,玻璃化液融化,解凍液進入管內(nèi),用指頭封住另一端,則卵母細胞排出。卵母細胞在解凍液中分步平衡15min,以充分脫出卵母細胞內(nèi)的抗凍劑。最后將卵母細胞用基礎(chǔ)液洗2次,每次5min。隨后卵母細胞進行成熟培養(yǎng)。(3)鋁土色液氮凍存液的制備將10個左右卵母細胞預(yù)處理后,移入15μL玻璃化液中,然后用微量移液槍和槍頭將含有卵母細胞的所有玻璃化液吸入槍頭,迅速推射到事先在液氮中平衡好的鋁箔表面上,玻璃化冷凍液迅速冷凍成球形小滴,用一端在液氮中浸泡過的鑷子將小滴夾入裝有液氮的凍存管中,所有的操作時間控制在30s內(nèi)。液氮中保存,1周內(nèi)解凍。用鑷子將凍存管中的紅色(PBS中加了酚紅)小球拿出后,迅速放入裝有1mL第1步解凍液中的dorf管中,5min后,轉(zhuǎn)入裝有3mL第2步解凍液的Φ3.5cm的塑料皿,5min后將卵母細胞檢出,轉(zhuǎn)入第3解凍液中。以后的步驟與GMP法相同。1.4正常率的計算在實體顯微鏡下,卵丘細胞未脫落(分步脫除保護劑后)、透明帶完整、胞質(zhì)均勻(無斑)的卵母細胞判為形態(tài)正常。1.5分散率的統(tǒng)計卵丘能正常擴散(放射冠未擴散而外層卵丘擴散也計為擴散)、呈粘稠的棉絮狀的卵母細胞判為擴散卵。1.6卵母細胞的分離和培養(yǎng)用0.2%的透明質(zhì)酸酶在培養(yǎng)箱中消化5min后,用外徑為200μm左右的玻璃管吹打直至卵丘完全脫落,在100×倒置顯微鏡下統(tǒng)計排出第1極體的卵母細胞所占的比率。1.7統(tǒng)計分析用方差分析和t檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行處理。2不同玻璃化冷凍保護劑的添加量2.1不同緩沖劑對牛卵母細胞體外成熟的影響從表1可以看出,成熟培養(yǎng)液中添加25mmol/LHEPES對卵母細胞的體外成熟有顯著影響(P<0.05),而同時添加10mmol/LHEPES和26.2mmol/LNaHCO3或僅添加26.2mmol/LNaHCO3,兩者之間無顯著差異(P>0.05)。2.2卵源對牛卵母細胞體外成熟的影響從表2可以看出,對卵源進行選擇得到的卵,其成熟能力顯著高于未選擇卵源對照組(P<0.05)。2.3程序冷凍中不同冷凍保護劑組合對牛卵泡卵母細胞冷凍效果的影響從表3可以看出,在3項指標中,添加0.1mol/L的蔗糖顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)好于添加0.3mol/L蔗糖,而且在程序冷凍中用乙二醇比甘油更適合作為滲透性冷凍保護劑(P<0.05);其中,10%乙二醇+0.1mol/L蔗糖組成熟率平均可達21.67%,極顯著地高于其他試驗組(P<0.01)。2.4玻璃化冷凍中不同冷凍保護劑對牛卵泡卵母細胞冷凍效果的影響從表4可以看出,甘油作為玻璃化冷凍平衡液的效果極顯著低于對照組和其他2組(P<0.01),乙二醇和甘油混合添加的效果與僅添加乙二醇無顯著差異(P>0.05),所有冷凍組的擴散率和成熟率都極顯著低于未冷凍組(P<0.01)。2.5玻璃化冷凍中平衡溫度對牛卵泡卵母細胞冷凍效果的影響從表5可以看出,無論是形態(tài)正常率、擴散率和成熟率,生理溫度(38.5℃)和室溫(25℃)兩者之間均無差異,而且極顯著高于低溫(4℃)下的冷凍效果。2.6玻璃化冷凍預(yù)平衡中冷凍保護劑濃度對牛卵泡卵母細胞冷凍效果的影響從表6可以看出,在預(yù)平衡過程中添加5%冷凍保護劑即可達到平衡的目的,但是太低的濃度(1%)在10min的預(yù)平衡過程中不能很好地起到平衡效果。2.7玻璃化冷凍中不同解凍方法對牛卵泡卵母細胞冷凍效果的影響從表7可以看出,解凍時三步法的形態(tài)正常率顯著高于一步解凍,成熟率也極顯著高于一步法。2.8幾種最小樣本量玻璃化冷凍方法的比較每次將采集到的COC隨機分成3個冷凍組和1個對照組(未冷凍),每個處理重復(fù)4次。4個組中,除對照組外,3個試驗組的COC分別用拉細毛細玻璃管(GMP細)、未經(jīng)拉細的毛細玻璃管(GMP)和鋁箔表面這3種載體來冷凍,比較各組解凍、培養(yǎng)后的成熟率。結(jié)果見表8。由表8可以看出,對照組卵母細胞成熟率極顯著地高于試驗組(P<0.01);拉細毛細玻璃管法冷凍解凍后的成熟率也極顯著高于另外2個試驗組(P<0.01);未拉細毛細玻璃管組和鋁箔表面冷凍組差異不明顯。3討論3.1最佳體外操作液ph值的確定一般開放操作,培養(yǎng)系統(tǒng)中都要添加HEPES。本試驗在配制成熟培養(yǎng)基礎(chǔ)液時,發(fā)現(xiàn)在每100mL含0.95gM199粉劑溶解液中添加0.22gNaHCO3后,溶液的pH值即可維持在7.2±0.1內(nèi),而添加25mmol/LHEPES后,pH值下降到6.8左右,需要對pH值進行調(diào)整。從本試驗結(jié)果可以看出,在牛卵母細胞成熟培養(yǎng)中僅僅添加26.2mmol/LNaHCO3即可維持pH的穩(wěn)定。因此,以DPBS作為體外操作液,26.2mmol/LNaHCO3緩沖的M199作為培養(yǎng)液的系統(tǒng)可以簡化操作過程。本試驗的結(jié)果與雷安民等的試驗結(jié)果一致。3.2引物利用的離體膜外生卵母細胞傳統(tǒng)的分類是將卵巢分為黃體期和卵泡期。但隨著腹腔鏡技術(shù)、B超技術(shù)以及體液分子檢測技術(shù)的日益成熟和應(yīng)用,推動了卵泡波理論的建立和不斷發(fā)展。一般認為牛的每個發(fā)情周期有2～3個卵泡波,每個卵泡波都經(jīng)歷一組卵母細胞的征集、選擇和優(yōu)勢化,但只有最后1個卵泡波中優(yōu)勢化的卵泡得以成熟、排卵。卵泡波理論在牛的超數(shù)排卵和胚胎移植實踐中有重要的理論指導(dǎo)意義?，F(xiàn)在國外除了胚胎移植應(yīng)用到該理論外,屠宰前超排、輸卵管體內(nèi)收集卵母細胞等體外生產(chǎn)胚胎也都以該理論為指導(dǎo)。本試驗根據(jù)Machat等的分類方法,將卵巢分為生長期卵巢和非生長期卵巢。結(jié)果表明,這種分類方法能作為一種簡便、直觀的選擇高質(zhì)量卵泡卵母細胞的方法。3.3保護劑添加量的篩選目前,胚胎的慢速冷凍中,大多添加一定濃度的非滲透性保護劑,力求使細胞進一步脫水和進一步稀釋離子濃度。卵泡卵體積遠大于胚胎細胞,因此慢速冷凍中卵母細胞的脫水將更困難,而且其脂膜對水和滲透性冷凍保護劑的通透性比成熟卵和胚胎細胞的脂膜更差。因此,本試驗探索了合適的冷凍保護劑的添加方法。試驗結(jié)果表明,高濃度(0.3mol/L)的非滲透保護劑蔗糖對卵母細胞的冷凍有不利影響,而低濃度(0.1mol/L)的蔗糖能提高卵母細胞的冷凍效果,而且發(fā)現(xiàn)乙二醇比甘油更適合作為程序冷凍中的滲透性保護劑。Suzuki等發(fā)現(xiàn),在程序冷凍液中添加0.05mol/L或0.1mol/L海藻糖比添加0.2mol/L或不添加海藻糖更能促進卵泡卵母細胞的受精率。但是Fabbri等在卵母細胞冷凍液中分別添加0.1、0.2、0.3mol/L的蔗糖,冷凍后發(fā)現(xiàn),添加0.3mol/L組卵母細胞的存活率(82%)顯著高于0.1mol/L組(34%)和0.2mol/L(60%)組,這可能是種屬之間的差異。3.4不同保護劑的使用效果本試驗以細管作為載體,力求尋找出既能使樣本液完全玻璃化,又能最大限度地減少保護劑毒性作用的玻璃化冷凍程序。在冷凍保護劑的選擇上,比較了單獨使用甘油(傳統(tǒng)、安全)、乙二醇(小分子量、滲透性好、毒性相對較低)和二者的混合使用對卵母細胞成熟的影響。結(jié)果表明,單獨使用甘油作玻璃化冷凍液的效果,不如單獨使用乙二醇或二者混合使用的效果,乙二醇和甘油等量混合使用也沒有表現(xiàn)出協(xié)作作用。該結(jié)果與Wani等在比較不同保護劑對水牛卵泡卵母細胞玻璃化冷凍中的結(jié)果一致。Francois等用25%EG+25%GL作為冷凍保護劑冷凍牛卵泡卵母細胞,解凍后體外成熟率為19.8%。本試驗結(jié)果與此結(jié)果接近。3.5冷卻溫度和溫度對牛卵母細胞發(fā)育的影響牛卵母細胞對溫度很敏感,太高的溫度和太低的溫度都會對卵母細胞造成損傷,因此需在兩者間尋求一個平衡點。Arav等認為,牛GV期卵母細胞的脂膜相變溫度在13～20℃。將未成熟卵在13℃和4℃維持相同時間,13℃組卵母細胞的成熟能力和發(fā)育能力低于4℃組。Zeron等實驗表明,GV期卵母細胞在16℃暴露15min后,受精率比對照組(39℃)低40%,而在4℃暴露相同的時間,受精率僅僅降低10%。因此Zeron等認為,牛卵母細胞冷卻時膜受到最大損傷是在16℃,與脂質(zhì)因溫度變化發(fā)生相變有關(guān)。Martino等和Pollard等的研究結(jié)果表明,當溫度降低到23℃乃至更低時,卵母細胞的卵裂能力顯著下降。Martino等報道,冷卻牛GV期卵母細胞至10℃和0℃,體外成熟率分別為63%和68%,與對照組的74%差異不顯著,但冷卻至10℃的發(fā)育率明顯下降,卵裂率和囊胚率分別為26%和6%,冷卻至0℃的卵母細胞,只有8%卵裂,囊胚率不到1%,均顯著低于對照組的61%和25%。從上述試驗不難看出,牛卵母細胞對溫度很敏感,而且牛卵母細胞的脂膜存在一個相變溫度。在相變溫度區(qū)間對牛卵母細胞進行冷凍,可能會使其發(fā)育能力大大下降。相變溫度以下的低溫(如4℃)會對牛卵母細胞造成一定冷凍損傷,但較相變區(qū)間溫度(如16℃)似乎更有利于牛卵母細胞的冷凍。為此,本試驗比較了卵母細胞在低溫(4℃)、室溫(25℃)和生理溫度(38.5℃)下平衡對冷凍效果的影響,結(jié)果表明,25℃和38.5℃無顯著差異,而4℃中平衡大大降低了冷凍效果,后者與Martino等和Pollard等研究結(jié)果一致,但與Martino等報道的冷凍后高成熟率相距甚遠。因此,牛卵母細胞的玻璃化冷凍可以在室溫或生理溫度下平衡,至于低溫(4℃和0℃)是否適合冷凍平衡,還有待進一步研究。3.6冷凍保護劑的選擇預(yù)平衡在細胞的冷凍中有很重要的作用。一個好的預(yù)平衡方法,可以在保證冷凍液完全形成玻璃化態(tài)的前提下,減少卵母細胞在高濃度玻璃化液中的暴露時間。因此,有必要通過試驗選擇出一個合適的冷凍保護劑預(yù)平衡濃度。本試驗結(jié)果表明,5%的EG即可達到預(yù)平衡效果。Papis等用6種不同濃度的EG(0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%)作為玻璃化的預(yù)平衡液來冷凍牛體外成熟的卵母細胞,發(fā)