新型香豆素苯并三唑類化合物的合成及生物活性研究

新型香豆素苯并三唑類化合物的合成及生物活性研究

香豆素是一種重要的含有苯并-這是一種重要的香氧環(huán)化合物。它具有良好的耐熱和耐光性。結(jié)構(gòu)固定簡單，易于組裝，易于引入各種功能基地。分子具有很大的共軛體系和較強(qiáng)的電子轉(zhuǎn)移能力。這種特殊的剛性配體結(jié)構(gòu)特征在許多食品、燃料、香味、材料、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、精細(xì)鑒定等領(lǐng)域具有廣泛的潛力。尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域,它們在抗細(xì)菌、抗真菌、抗癌、抗病毒、抗氧化、抗凝、抗炎等方面發(fā)揮重要作用,相關(guān)研究日益活躍,發(fā)展十分迅速,備受關(guān)注。一些香豆素類化合物如華法林(warfarin)、雙香豆素(dicoumarol)、醋硝香豆醇(acenocoumarol)、雙香豆素乙酯(ethylbiscoumacetate)、亮菌甲素(armillarisinA)、羥甲香豆素(hymecromone)、氯達(dá)香豆素(chloridarol)、卡波羅孟(carbochromen)等已廣泛應(yīng)用于臨床。更為重要的是越來越多的香豆素類化合物顯示出對多類疾病的治療具有巨大的發(fā)展?jié)摿?。隨著抗感染藥物的廣泛使用,甚至濫用,導(dǎo)致多藥耐藥菌株的不斷出現(xiàn)。特別是在2010年出現(xiàn)的耐藥性極強(qiáng)的超級病菌(含有NewDelhimetallo-β-lactamase1,NDM-1)幾乎能抵御所有的臨床抗感染藥物,致使新型高效抗感染藥物的開發(fā)已成為更為迫切的重大課題,受到當(dāng)今世界的廣泛關(guān)注和重視。眾所周知,喹諾酮類化合物是臨床首選的人工合成抗感染藥物之一,該類藥物具有抗菌譜廣、生物相容性好、組織滲透性強(qiáng)、給藥方便、口服利用率高、毒副作用小及開發(fā)成本低等諸多優(yōu)點,在治療革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、厭氧菌以及分枝桿菌等感染性疾病方面療效顯著。然而隨著喹諾酮藥物的大量而廣泛甚至不合理的使用,使得病原菌的耐藥性問題日趨嚴(yán)峻,喹諾酮類藥物在臨床上的作用越來越有限。由于喹諾酮類藥物在感染性疾病治療領(lǐng)域的優(yōu)勢,吸引著許多工作者致力于喹諾酮(吡啶酮酸類)類似物香豆素(苯并α-吡喃酮)類化合物的研究,期望開發(fā)出類似于喹諾酮的抗微生物藥物。一些天然的香豆素類化合物如香豆霉素(coumermycinA1)、新生霉素(novobiocin)、氯新生霉素(chlorobiocin)等已得到廣泛研究,它們不僅可通過抑制三磷酸腺苷酶的活性阻礙DNA的超螺旋,導(dǎo)致細(xì)菌死亡,還可作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II,干擾DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和染色體的分離,從而有效抑制細(xì)菌的生長。然而該類化合物水溶性差、抑制革蘭陰性菌的能力弱和毒副作用大等致使其至今未能廣泛應(yīng)用于臨床。近些年來,許多人工合成的香豆素類化合物顯示出了良好的抗微生物活性及寬的抗微生物譜,具有開發(fā)成藥的希望,值得一提的是一些化合物能有效地抑制耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistantStaphylococcusaures,MRSA)的生長,致使無數(shù)研究者致力于香豆素類藥物的開發(fā)。眾多研究發(fā)現(xiàn),一些氮雜環(huán)如吡咯、噻唑、吡唑等引入到香豆素類化合物(如1~4)(圖1),顯示出良好的生物活性,且其抗細(xì)菌、抗真菌能力比一些臨床藥物更強(qiáng),具有成藥的潛力[14,15,16,17,18,19]。盡管已經(jīng)有多種氮雜環(huán)被研究,然而迄今為止將苯并三唑引入香豆素的研究未見文獻(xiàn)報道。苯并三唑是一個重要的芳香氮雜環(huán)化合物,可作為苯并咪唑、咪唑、三唑等的等排體,能通過形成氫鍵、離子鍵、分子間π-π堆積、靜電作用等有效調(diào)節(jié)藥物分子的脂水分配系數(shù),改變藥物分子的理化性質(zhì),改善藥物的藥代動力學(xué)性質(zhì),進(jìn)而提高生物活性。因此,苯并三唑環(huán)被廣泛地用于構(gòu)筑藥物分子。一些結(jié)構(gòu)簡單的N-取代的苯并三唑類化合物如5~8(圖2)已經(jīng)顯示出了廣譜抗微生物活性。本課題組長期致力于結(jié)構(gòu)新穎的唑類氮雜環(huán)抗感染藥物研發(fā)[24,25,26,27,28,29,30,31,32],在近來的研究中發(fā)現(xiàn)將1,2,4-三唑氮雜環(huán)引入香豆素所得到的香豆素三唑化合物具有良好的抗微生物活性,具有發(fā)展成抗感染藥物的潛力,作為在該領(lǐng)域研究的繼續(xù),本文將1,2,3-苯并三唑作為1,2,4-三唑的等排體與香豆素鍵連,得到一系列香豆素苯并三唑新化合物,并考察其體外抗微生物能力。一些文獻(xiàn)顯示,橋鏈基團(tuán)可調(diào)節(jié)藥物分子的理化性質(zhì)、脂水分配系數(shù)及空間構(gòu)型等,改善藥物與靶點的結(jié)合,從而影響其生物活性。鑒于此,本文考察不同長度的烷基鏈和取代位置不同的芳基鏈對香豆素苯并三唑類化合物體外抗微生物活性的影響。許多研究表明,臨床上將兩種或兩種以上藥物聯(lián)用所產(chǎn)生的協(xié)同作用常能提高藥效和生物利用度、消除和減輕毒副作用及過敏反應(yīng)、克服多藥耐藥性問題以及治療單一藥物不能治愈的嚴(yán)重混合性疾病,此外聯(lián)合用藥研發(fā)還存在開發(fā)成本低、周期短、成功可能性大等諸多優(yōu)點,因此其研究較活躍,應(yīng)用也日趨廣泛。將作用靶點不同的藥物聯(lián)用,如抗真菌藥伏立康唑(voriconazole)、卡泊芬凈(caspofungin)和兩性霉素B(amphotericinB)合用,不僅可減少用藥劑量,還能有效抑制氟康唑不敏感的曲霉菌屬的生長。香豆素類化合物是II型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、DNA回旋酶的抑制劑,而氯霉素和氟康唑則分別作用于細(xì)菌原核細(xì)胞內(nèi)核糖體50s亞基和真菌羊毛甾醇14α-去甲基化酶。因此,本文也考察了不同作用靶點的香豆素苯并三唑與氯霉素或氟康唑聯(lián)用體外協(xié)同抗細(xì)菌和抗真菌活性。目標(biāo)化合物香豆素苯并三唑的合成見合成路線1。以間苯二酚為起始原料,與乙酰乙酸乙酯環(huán)化得中間體4-甲基-7-羥基香豆素9,進(jìn)一步通過羥基的醚化反應(yīng)制備香豆素溴化物10a~10e和12a~12c,再與1H-1,2,3-苯并三唑的N-烷化得到香豆素苯并三唑11a~11e和13a~13c。新化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)1HNMR、IR、MS和元素分析證實。結(jié)果與討論1化學(xué)成分1.1香豆素素合成1.1.17-甲基香豆素9的合成1.1.2采用7-羥基-4-甲基香豆素、二溴化合物及碳酸鉀的投料比化合物10a~10e及12a~12c的合成參照文獻(xiàn)方法。文獻(xiàn)采用7-羥基-4-甲基香豆素、二溴化合物及碳酸鉀的投料摩爾比為1∶1∶1,但反應(yīng)中由于副產(chǎn)物雙香豆素14(圖3)的產(chǎn)生,導(dǎo)致產(chǎn)率較低,僅為44%。1.1.3香豆素-3,5-三唑類化合物的合成苯并三唑存在1H-1,2,3苯并三唑和2H-1,2,3苯并三唑兩種互變異構(gòu)體(圖4),在堿性條件下形成的負(fù)離子存在A、B和C3種共振式,其中A和C實質(zhì)上等同,為動力學(xué)穩(wěn)定共振式,而B為熱力學(xué)穩(wěn)定共振式,因此苯并三唑在堿性條件下可發(fā)生親核取代反應(yīng),產(chǎn)生1(或3)-位、2-位氮取代產(chǎn)物。在低溫或室溫的弱堿性條件下,苯并三唑主要以動力學(xué)穩(wěn)定構(gòu)象即A和C的形式存在,易于得到1(或3)-位N取代苯并三唑類化合物,但是隨著溫度逐漸升高或堿性的增強(qiáng),動力學(xué)穩(wěn)定的A、C構(gòu)象轉(zhuǎn)化為熱力學(xué)穩(wěn)定的B構(gòu)象,相應(yīng)的得到2-位N取代的苯并三唑類化合物。此外研究表明熱力學(xué)穩(wěn)定的2-位氮取代的苯并三唑衍生物極性大于動力學(xué)穩(wěn)定的1(或3)-位氮取代的苯并三唑衍生物(圖5)。因此,本文以乙腈作溶劑、碳酸鉀作堿、50℃時先將堿與苯并三唑在乙腈中攪拌1h,讓其充分形成鉀鹽,冷卻至室溫,這時反應(yīng)體系中主要以A、C構(gòu)象負(fù)離子存在,再加入香豆素溴化物,生成I和II兩種形式產(chǎn)物(圖5),且產(chǎn)物I即1(或3)-位N取代產(chǎn)物的產(chǎn)率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于產(chǎn)物II即2-位氮取代衍生物。此外,苯并三唑稍過量,使目標(biāo)化合物香豆素苯并三唑以高產(chǎn)率(79%~83%)獲得。1.2香豆素苯并三唑環(huán)的化學(xué)位移香豆素新化合物11~13結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、1HNMR、MS以及元素分析證實。紅外波譜(IR)數(shù)據(jù)表明,所有香豆素苯并三唑給出相似的紅外吸收峰。其特征吸收峰波數(shù)變化不大。香豆素環(huán)上羰基(C=O)伸縮振動的特征吸收峰出現(xiàn)在1709~1723cm-1。橋基對香豆素環(huán)上羰基的紅外波數(shù)有一定影響。隨著烷基橋鏈的增長,羰基的紅外吸收峰波數(shù)依次輕微增大,當(dāng)橋基碳原子達(dá)到4個時,波數(shù)達(dá)到最大(1723cm-1),烷基橋鏈繼續(xù)增長時,羰基峰移向低波數(shù)(圖6)。若橋基中引入芳香環(huán),也出現(xiàn)類似現(xiàn)象。當(dāng)橋基為鄰位取代,即其有效碳鏈為4個碳時,化合物13a中羰基峰的紅外波數(shù)最大,為1722cm-1。隨著有效碳鏈增長,羰基紅外吸收峰波數(shù)降低,如化合物13b(橋基為間二芐基,有效橋鏈長度為5個碳原子)和13c(橋基為對二芐基有效橋鏈長度為6個碳原子)羰基紅外波數(shù)分別降為1716和1705cm-1。香豆素苯并三唑中芳環(huán)上的C-H伸縮振動則在3107~3039cm-1區(qū)域出現(xiàn)弱或中等強(qiáng)度的吸收帶橋基類型如芳基和烷基、橋基長度、以及橋鏈芳環(huán)上取代位置對香豆素環(huán)和苯并三唑環(huán)上的C-H紅外波數(shù)影響較小。核磁1H譜表明,由于香豆素9具有較大的芳香共軛體系,降低了羥基中質(zhì)子的電荷密度,使得羥基質(zhì)子給出非常大的化學(xué)位移(δ13.44)。在各類香豆素化合物中,包括羥基未取代的香豆素9、溴烷基類10、溴芳基類12以及對應(yīng)的苯并三唑類11和13,香豆素環(huán)上3-位和5-位質(zhì)子以及4-位甲基質(zhì)子的化學(xué)位移沒有大的變化,分別出現(xiàn)在δ7.48~7.53、6.13~6.16和2.35~2.40,表明化合物9中香豆素環(huán)上7-位羥基修飾后對遠(yuǎn)離取代基的環(huán)上3-、5-位質(zhì)子和4-位甲基質(zhì)子的化學(xué)位移影響不大。而距離7-位取代基較近的香豆素上6-位質(zhì)子Ha和8-位質(zhì)子Hb的化學(xué)位移則發(fā)生明顯的改變。香豆素環(huán)上7-位羥基取代后的Ha和Hb的化學(xué)位移均移向高場。與化合物9比較,含供電子的烷基香豆素10和11的Ha和Hb分別向高場移動約0.08~0.1,而芳基香豆素12和13的Ha和Hb向高場僅有輕微的移動,分別約0.02~0.04(表1)。在化合物10~13中,由于大共軛體系的香豆素環(huán)臨近Hc質(zhì)子,使質(zhì)子去屏蔽作用強(qiáng)于Hd,導(dǎo)致Hc比對應(yīng)的Hd有更大的低場化學(xué)位移。香豆素溴化物10和12中的Br被苯并三唑芳雜環(huán)取代后使其鄰近的Hd質(zhì)子去屏蔽效應(yīng)增強(qiáng),致使對應(yīng)的香豆素苯并三唑11和13中Hd質(zhì)子向低場有較大幅度的移動,且橋基類型與長度對Hc和Hd的化學(xué)位移有較大影響。烷基溴化物10中的Hc(10e的Hc為4.71)和Hd(10e的Hd為3.54)的化學(xué)位移比對應(yīng)的芳基溴化物12的Hc(12b的Hc為4.88)和Hd(12b的Hd為4.11)小。含脂肪橋基的香豆素苯并三唑11中Hc在4.73~5.15和Hd在4.01~4.73分別出現(xiàn)三重峰,其化學(xué)位移小于含芳香橋基的化合物13的單峰Hc(5.44~5.48)和Hd(5.13~5.16)。且含脂肪橋基的化合物11中Hc和Hd隨著烷基鏈增長,其化學(xué)位移輕微地向高場移動。此外,化合物11a~11e和13a~13c中苯并三唑環(huán)上的質(zhì)子由于離取代基較遠(yuǎn),其化學(xué)位移變化較小。香豆素苯并三唑類化合物的質(zhì)譜均呈現(xiàn)出[M+Na]+和[M+H]+分子離子峰。元素分析數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實化合物結(jié)構(gòu)與預(yù)期相符。2微生物活性部分2.1香豆素苯并三唑類化合物體外抗細(xì)菌活性數(shù)據(jù)見表2。合成的香豆素類化合物9~13對所測試的細(xì)菌具有不同程度的抑制作用。羥基未取代的香豆素9對革蘭陽性菌S.aureus、B.subtilis和M.luteus具有中等抑制活性(MIC=32μg·mL-1),抗菌活性明顯低于參考藥物氯霉素(MIC4~16μg·mL-1)。其羥基烷化后的化合物10a~10e和12a~12c抗細(xì)菌活性均大大減弱或消失,表明香豆素環(huán)上烷基或芳基的引入不利于增強(qiáng)其抗細(xì)菌活性。然而,化合物10a~10e和12a~12c的溴原子用苯并三唑環(huán)取代后得到的香豆素苯并三唑11a~11e和13a~13c具有顯著的抗細(xì)菌(MRSA除外)能力,其活性比它對應(yīng)的溴化物前體10a~10e和12a~12c強(qiáng)得多,這表明苯并三唑?qū)刮⑸锬芰ζ鹆酥匾饔?。香豆素苯并三?1a~11e和13a~13c對B.Subtilis、E.coli、S.typhi、S.dysenteriae和MRSA具有中等、弱或無明顯的抑制活性,但能有效抑制S.aureus、M.luteus及P.vulgaris的生長,其中含烷基橋鏈(CH2)2的化合物11a抑制革蘭陽性菌S.aureus和M.luteus的生長能力(MIC=4μg·mL-1)與陽性對照氯霉素(MIC=4μg·mL-1)相當(dāng),含(CH2)3橋鏈的化合物11b抗S.aureus和M.luteus的活性(MIC=2μg·mL-1)是氯霉素的2倍,本文制備的所有香豆素苯并三唑包括烷基類11a~11e和芳基類13a~13c對革蘭陰性菌P.Vulgaris的抑制活性(MIC=4~8μg·mL-1)均比氯霉素(MIC=16μg·mL-1)高2~4倍。因此,苯并三唑環(huán)的引入不僅顯著提高了香豆素類化合物體外抗細(xì)菌活性,還大大提高了香豆素類化合物抑制革蘭陰性菌生長的能力。香豆素苯并三唑類化合物作為抗細(xì)菌藥物顯示出巨大潛力,值得進(jìn)一步研究開發(fā)。香豆素苯并三唑類化合物中橋鏈基團(tuán)對抗細(xì)菌活性具有顯著的影響。烷基橋鏈化合物11a~11e抑制細(xì)菌生長的能力比芳基橋鏈的化合物13a~13c更強(qiáng),且抗菌譜更寬。橋鏈的長度也影響抗菌活性,短的烷基橋鏈如(CH2)2和(CH2)3的引入有助于提高香豆素苯并三唑類化合物抗革蘭陽性菌S.aureus和M.luteus的活性,隨著碳鏈的增長,活性降低,而中等長度烷基橋鏈如(CH2)4和(CH2)5則有助于增強(qiáng)抑制S.typhi和S.dysenteriae生長的能力。而橋鏈基團(tuán)對目標(biāo)化合物抗MRSA及P.vulgaris活性似乎沒有太大的影響。橋鏈基為芳香環(huán)時其取代位置的改變對化合物13a~13c的抗細(xì)菌活性也沒有明顯影響。由此可見,橋鏈基團(tuán)的變化不僅影響目標(biāo)化合物的抗菌活性,還具有選擇性抑菌作用。該類化合物的抗細(xì)菌作用機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系及其結(jié)構(gòu)優(yōu)化還有待進(jìn)一步研究。2.2目標(biāo)化合物的活性體外抗真菌活性結(jié)果見表2。中間體香豆素9及其溴化物10a~10e和12a~12c體外均無明顯抗真菌活性。而目標(biāo)化合物特別是香豆素苯并三唑11a~11e對所測試真菌,包括對氟康唑不敏感的A.fumigatus均有中等的抑制活性,且化合物11a~11d抗A.fumigatus活性(MIC=64μg·mL-1)強(qiáng)于參考藥物氟康唑(MIC=128μg·mL-1)?？梢娤愣顾乇讲⑷蝾惢衔锟骨咕I(lǐng)域的研究值得進(jìn)一步探索。2.3香豆素苯并三唑的聯(lián)用氯霉素與香豆素苯并三唑11a或13c聯(lián)用抗細(xì)菌活性測試結(jié)果如表3所示。用0.5~2μg·mL-1的氯霉素與香豆素苯并三唑(11a或13c)聯(lián)用即可發(fā)揮有效的抑菌作用,用藥劑量較香豆素苯并三唑(2~256μg·mL-1)或氯霉素(4~16μg·mL-1)單獨(dú)使用時顯著減少,抗菌能力增強(qiáng)了4~8倍,且FIC指數(shù)均小于等于0.5,呈現(xiàn)出良好的協(xié)同抑菌作用。特別是化合物13c與氯霉素聯(lián)用后對S.typhi、S.dysenteriae、E.coli及B.subtilis的抑制能力顯著強(qiáng)于13c(≥256μg·mL-1)。此外,最值得關(guān)注的是聯(lián)合用藥后具有顯著的抗MRSA活性。眾所周知,MRSA作為感染性疾病的主要致病菌之一,對喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、氨基糖苷、β-內(nèi)酰胺以及參考藥物氯霉素等臨床抗菌藥物都具有較強(qiáng)的耐藥性。其所引起的感染,如心內(nèi)膜炎、肺炎等治療十分困難,嚴(yán)重危害了人類生命。因此,MRSA感染的治療成了當(dāng)前醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點和難點。本研究發(fā)現(xiàn)僅2μg·mL-1的氯霉素分別與香豆素苯并三唑11a或13c聯(lián)用后,即可有效地抑制MRSA的生長,抗MRSA活性是氯霉素的8倍。由此可見,香豆素苯并三唑的添加在氯霉素抗細(xì)菌活性中發(fā)揮了重要的作用,它們的添加不僅提高了氯霉素的抗細(xì)菌活性,還拓寬了其抗細(xì)菌譜。從理論上分析,可能是由于香豆素類化合物和氯霉素抗菌作用靶點不同,聯(lián)用時相互影響產(chǎn)生的協(xié)同作用,增強(qiáng)了抗菌作用,減少了用藥劑量,提高了抗菌能力。其相關(guān)協(xié)同作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。2.4香豆素苯并三唑聯(lián)cr氟康唑與香豆素苯并三唑11a或13c聯(lián)用抗真菌活性測試結(jié)果(表4)表明,香豆素苯并三唑與氟康唑聯(lián)用顯示出良好的抗C.albicans、S.cerevisiae和A.fumigatus活性。氟康唑(0.25~0.5μg·mL-1)中添加一定量的香豆素苯并三唑11a或13c即能有效的抑制C.albicans和S.cerevisiae的生長。因此,有望通過與香豆素苯并三唑聯(lián)用來改善氟康唑因用藥劑量大所導(dǎo)致的耐藥性及毒性問題。該類研究還有望改善氟康唑抗菌譜窄的問題,拓展唑類化合物在抗曲霉菌屬領(lǐng)域的應(yīng)用。3化合物的抗微生物活性本文以間苯二酚和乙酰乙酸乙酯為起始原料經(jīng)環(huán)化、醚化及1H-1,2,3-苯并三唑的N-烷化反應(yīng)合成了一系列香豆素苯并三唑新化合物,化合物結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、1HNMR、MS譜和元素分析證實。合成的化合物對所測試的細(xì)菌和真菌呈現(xiàn)出了不同程度的抑制作用。其中目標(biāo)化合物11a和11b抗S.aureus、M.luteus活性與氯霉素相當(dāng);化合物11a~11e和13a~13c抑制P.vulgaris生長能力強(qiáng)于氯霉素;化合物11a~11d對A.fumigatus抑制活性優(yōu)于氟康唑。因此香豆素苯并三唑類化合物作為抗微生物藥物具有開發(fā)潛力,值得進(jìn)一步研究。此外,抗感染藥物氯霉素、氟康唑與香豆素苯并三唑聯(lián)用后,抗微生物效果較其單獨(dú)使用增強(qiáng)了2~8倍,特別是香豆素苯并三唑與氯霉素聯(lián)用后所顯示的顯著抗MRSA活性,對多藥耐藥菌株的治療及人類健康具有深遠(yuǎn)意義。此外,與氟康唑聯(lián)用所顯示的良好抗A.fumigatus活性有望拓展唑類化合物在抗曲霉菌領(lǐng)域的應(yīng)用。香豆素苯并三唑與更多臨床抗感染藥物聯(lián)用值得進(jìn)一步研究,有望為感染類疾病的治療作出貢獻(xiàn)。實驗部分1核磁共振測試儀器熔點儀:X-6型精密顯微熔點測定儀(溫度未校正);紅外光譜儀:Bio-RadFTS-185,BrukerRFS100/S(KBr壓片,測試范圍400~4000cm-1);核磁共振儀:BrukerAV300核磁共振儀(TMS內(nèi)標(biāo));質(zhì)譜儀:LCMS-2010A(ESI電離源);元素分析儀:CarloErba1106型元素分析儀。2香豆素13的合成和結(jié)構(gòu)性能2.17-羥基-4-甲基香豆素9的合成在裝有回流冷凝管的150mL單頸瓶中依次加入間苯二酚(11.0g,100mmol)、乙酰乙酸乙酯(13.6g,100mmol)和草酸(5.2g,50mmol),80℃攪拌8h至反應(yīng)完全(TLC跟蹤反應(yīng),展開劑:石油醚-乙酸乙酯,v/v=2∶1),冷卻至室溫,反應(yīng)物倒入冰水中攪拌10min,析出淡黃色固體,靜置抽濾。固體用水洗滌,再用乙醇重結(jié)晶,烘干得白色固體7-羥基-4-甲基香豆素(9)15.4g,產(chǎn)率95%;熔點192~193℃(CAS號:90-33-5;文獻(xiàn)熔點:184~185℃);1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:13.47~13.41(br,1H,coumarinOH),7.51(d,J=5.3Hz,1H,coumarin5-H),6.90~6.88(m,2H,coumarin6,8-H),6.15(s,1H,coumarin3-H),2.37(s,3H,coumarin-CH3)。2.2香豆素烷基溴化物10a11e2.2.17-2-溴乙醇-4-甲基香豆素7-2-br離子-4-meth-1-chromen-210a2.2.27-3-溴代丙氧基-4-甲基香豆素7-3-鄰居-4-meth-4-meth-110b2.2.37-4-溴代扣氧基-4-甲基香豆素7-4-bro-android-4-methyl-2-c10c2.2.47-5-溴代戊氧基-4-甲基香豆素7-5-羥色胺-4-meth-to-2-c10d2.2.57-6-溴化二羥基-4-甲基香豆素7-6-黑客，霍洛夫-4-meth-2-配方-210e2.3香豆素烷基苯并三醇11a11e2.3.17-2-，1-硝基溶膠-4-甲基香豆素7-2-，1-yl和化合物-4-meth-t-2-c11a2.3.27-3-，1-硝基溶膠-4-甲基香豆素7-3-trol-1-yl-4-meth-t-2-111b2.3.37-4-，1-硝基溶膠-4-甲基香豆素7-4-trol-1-yl-4-meth-to2-111c2.3.47-5-氨基溶膠-1-硝基-4-甲基香豆素7-5-棕櫚酸-1-yl-4-meth-1-h-c-meth-111d2.3.57-6-苯基二羥氯仿-1基-4-甲基香豆素7-6-棕櫚酸-1-yl-4-meth-1-h-c-meth-1-yl11e2.4香豆素溴化物12a12c2.4.17-2-溴甲基-4-甲基香豆素7-2-堿性-4-meth-4-meth-1-h-c-12a2.4.37-4-羧甲基-4-甲基香豆素7-4-堿性-4-meth-4-meth-1-h-c中的12c2.5香豆素苯并三醇13a13c2.5.17-2-，1-基苯基甲醛-4-甲基香豆素7-，2-t-yl-1-ylmeth-4-meth-6-113a2.5.27-3-苯甲醛-4-甲基香豆素-4-甲基香豆素7-3-trol-1ylmethyl-4-meth-2-c-13b2.5.37-4-苯甲醛-4-甲基香豆素-4-甲基香豆素7-4-tyl-1-yl-4-meth-6-113c3關(guān)于戶外抗微生物活性的研究3.1dmso與香豆素類化合物的鑒別香豆素類化合物9~13的體外抗菌活性測試采用的是美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NationalCommitteeforClinicalLaboratoryStandards,NCCLS)推薦的倍比稀釋藥敏法。香豆素類化合物和參考藥物均用DMSO溶解配制成母液,采用倍比稀釋法使得藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg·mL-1。為了排除溶劑DMSO對體外抗菌活性測試的影響,DMSO含量低于1%。此外96孔板12號孔作為陽性對照不加藥。臨床上廣泛使用的氯霉素作為參考藥物。用最小抑制濃度(MIC,μg·mL-1)來表征化合物抗細(xì)菌能力的強(qiáng)弱。3.2抗細(xì)菌和抗真菌實驗香豆素類化合物9~13的體外抗真菌活性測試采用倍比稀釋法,藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5和0.25μg·mL-1。上述抗細(xì)菌、抗真菌實驗均平行操作3次,能重復(fù)的MIC值準(zhǔn)確記錄;偏差較大組,重新進(jìn)行測試直到符合要求為止?？刮⑸锘钚越Y(jié)果見表2。3.3香豆素苯并三唑氯霉素聯(lián)合抑菌效果測定根據(jù)所測得的香豆素苯并三唑11a和13c以及氯霉素對測試細(xì)菌的MIC值,依據(jù)NCCLS規(guī)定的抗微生物活性測試標(biāo)準(zhǔn),采用棋盤法(香豆素苯并三唑與氯霉素濃度為單獨(dú)用藥時MIC的1/8、1/4、1/2、1和2倍)測定香豆素苯并三唑11a或13c與氯霉素聯(lián)用時抑制細(xì)菌生長能力。聯(lián)合抑菌效果用FIC(fractionalinhibitoryconcentration)指數(shù)來考核。測試結(jié)果見表3。3.4配合藥物的mic/協(xié)同作用依據(jù)所測的香豆素苯并三唑11a和13c及氟康唑?qū)y試真菌的MIC值,采用棋盤法測定香豆素苯并三唑與氟康唑合用時抗真菌活性。測試結(jié)果見表4。FIC指數(shù)=聯(lián)合用藥后香豆素苯并三唑MIC/聯(lián)合用藥前香豆素苯并三唑MIC+聯(lián)合用藥后參照藥物的MIC/聯(lián)合用藥前參照藥物的MIC(FIC指數(shù):≤1兩者為協(xié)同作用;1~2為無關(guān);>2為拮抗作用)。中間體7-羥基-4-甲基香豆素(9)的合成,文獻(xiàn)方法一般以間苯二酚和乙酰乙酸乙酯為原料,以濃硫酸等強(qiáng)酸作催化劑制備,但該方法存在選擇性差,伴有氧化、磺化等副反應(yīng),后處理繁瑣、對環(huán)境污染大等缺點。本文改用草酸作催化劑,無溶劑進(jìn)行Pechmann環(huán)化制備香豆素9,產(chǎn)率可達(dá)95%。與濃硫酸作催化劑相比,本方法存在產(chǎn)率高、后處理簡便、環(huán)境污染小及易于工業(yè)化等優(yōu)點。本研究對此實驗方案進(jìn)行了改進(jìn),將投料比改為1∶1.2∶1.5,有效地減少了二溴化合物偶聯(lián)兩個香豆素形成副產(chǎn)物14,從而有利于目標(biāo)香豆素溴化物的生成,使得目標(biāo)化合物10a~10e及12a~12c產(chǎn)率提高至79%~86%。1.1儀器1.2試劑及儀器硅膠:青島海洋化工廠;間苯二酚、乙酰乙酸乙酯、烷基二溴化物、1H-1,2,3-苯并三唑及其他所需試劑均為市售分析純;鄰二芐溴、間二芐溴、對二芐溴:自制(制備方法參考文獻(xiàn));氟康唑:富陽金伯士化工有限公司;氯霉素:四川泰華堂制藥有限公司;牛肉膏、蛋白胨、RMPI1640(GibcoBRL)、嗎啡啉丙磺酸、瓊脂、葡萄糖、酵母浸膏等:北京奧博星生物技術(shù)有限公司。1.3化合物10a,10e的合成體外抗微生物活性測試的細(xì)菌包括4株革蘭陽性菌:金葡菌ATCC25923、耐甲氧西林金葡菌N315、枯草芽孢桿菌ATCC6633和藤黃微球菌ATCC4698;4株革蘭陰性菌:大腸桿菌ATCC25922、變形桿菌ATCC6896、傷寒沙門菌ATCC9484和痢疾志賀菌ATCC49550;3株真菌:白色念珠菌ATCC76615、釀酒酵母菌ATCC9763和對氟康唑不敏感的煙曲霉菌ATCC96918由西南大學(xué)藥學(xué)院和中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)提供。將7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、1,2-二溴乙烷(2.2g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)及丙酮(50mL)加入到裝有回流冷凝管的100mL單頸瓶中,加熱回流。攪拌5h后反應(yīng)完全(TLC跟蹤反應(yīng),展開劑:石油醚-氯仿,v/v=1∶1)。冷卻至室溫,減壓蒸餾回收丙酮,水溶解反應(yīng)體系中的固體,二氯甲烷(50mL×3)萃取,合并有機(jī)相,無水Na2SO4干燥,濃縮,硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-石油醚,v/v=1∶1),得白色固體7-(2-溴代乙氧基)-4-甲基香豆素(10a)2.4g,產(chǎn)率84%;熔點107~108℃(文獻(xiàn)值:106~108℃)?；衔?0b的合成參照化合物10a的制備方法,起始原料為7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、1,3-二溴丙烷(2.4g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)及丙酮(50mL)。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:乙酸乙酯-石油醚,v/v=1∶4),得白色固體7-(3-溴代丙氧基)-4-甲基香豆素(10b)2.6g,產(chǎn)率85%;熔點83~84℃(文獻(xiàn)值:83~84℃)。化合物10c的合成參照化合物10a的制備方法,起始原料為7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、1,4-二溴丁烷(2.6g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)以及丙酮(50mL)。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:乙酸乙酯-石油醚,v/v=1∶4),得白色固體7-(4-溴代丁氧基)-4-甲基香豆素(10c)2.7g,產(chǎn)率86%;熔點66~67℃(文獻(xiàn)值:66~67℃)。化合物10d的合成參照化合物10a的制備方法,起始原料為7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、1,5-二溴戊烷(2.7g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)以及丙酮(50mL)。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:乙酸乙酯-石油醚,v/v=1∶4),得白色固體7-(5-溴代戊氧基)-4-甲基香豆素(10d)2.70g,產(chǎn)率83%;熔點67~68℃(文獻(xiàn)值:67~68℃)?；衔?0e的合成參照化合物10a的制備方法,起始原料為7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、1,6-二溴己烷(2.9g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)及丙酮(50mL)。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:乙酸乙酯-石油醚,v/v=1∶4),得白色固體7-(6-溴代己氧基)-4-甲基香豆素(10e)2.9g,產(chǎn)率84%;熔點56~57℃;IR(KBr)ν:3088,3058(Ar-H),2937,2952,2865(CH2),1712(C=O),1627,1579,1521(aromaticframe),1465,1378,1364,1100,1010,994,875,841767,721,631cm-1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.50(d,J=6.0Hz,1H,coumarin5-H),6.80~6.77(m,2H,coumarin6,8-H),6.16(s,1H,coumarin3-H),4.71(t,J=6.3Hz,2Hcoumarin-OCH2),3.54(t,J=4.02Hz,2H,CH2Br),2.35(s,3H,coumarin-CH3),2.12~2.09(m,2H,coumarin-OCH2CH2),1.87~1.84(m,2H,CH2CH2Br),1.58~1.53(m,4H,coumarinOCH2CH2CH2CH2CH2CH2Br);ESI-MSm/z:341[M+2+H]+(81Br),339[M+H]+(79Br);Anal.Calcd.forC16H19BrO3:C55.65,H5.65;Found:C55.69,H5.60。在100mL單頸瓶中加入1H-1,2,3-苯并三唑(0.7g,6mmol)、碳酸鉀(1.1g,8mmol)及乙腈30mL,加熱至50℃攪拌1h,停止加熱,待體系冷卻至室溫,再加入7-(2-溴代乙氧基)-4-甲基香豆素(10a)1.4g(5mmol),室溫下繼續(xù)攪拌9h后反應(yīng)完全(TLC跟蹤反應(yīng),展開劑:氯仿-丙酮,v/v=3∶1)。減壓蒸餾回收乙腈,水溶解反應(yīng)體系中的固體,CH2Cl2(30mL×3)萃取3次,合并有機(jī)相,無水Na2SO4干燥,濃縮,硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-丙酮,v/v=3∶1),得白色固體7-(2-(1H-苯并三唑-1-基)乙氧基)-4-甲基香豆素(11a)1.3g,產(chǎn)率79%;熔點185~186℃;IR(KBr)ν:3093,3045(Ar-H),2955,2926,2879(CH2),1714(C=O),1619,1573,1511(aromaticframe),1396,1319,1300,1296,1150,1006,990,940,870,827,786,712cm-1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.86~7.84(m,2H,benzotriazole4,7-H),7.49(d,J=5.7Hz,1H,coumarin5-H),7.42~7.39(m,2H,benzotriazole5,6-H),6.82~6.79(m,2H,coumarin6,8-H),6.14(s,1H,coumarin3-H),5.15(t,J=3.2Hz,2H,coumarinOCH2),4.73(t,J=5.4Hz,2H,benzotriazole-CH2),2.38(s,3H,coumarin-CH3);ESI-MSm/z:344[M+Na]+,322[M+H]+;Anal.Calcd.forC18H15N3O3:C67.28,H4.71,N13.08;Found:C67.35,H4.70,N13.04。化合物11b的合成參照化合物11a的制備方法,起始原料為7-(3-溴代丙氧基)-4-甲基香豆素(10b)(1.5g,5mmol)、1H-1,2,3-苯并三唑(0.7g,6mmol)、碳酸鉀(1.1g,8mmol)以及乙腈30mL。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-丙酮,v/v=3∶1),得白色固體7-(3-(1H-苯并三唑-1-基)丙氧基)-4-甲基香豆素(11b)1.3g,產(chǎn)率82%;熔點170~171℃;IR(KBr)ν:3087,3065,3057(Ar-H),2942,2921,2854(CH2),1720(C=O),1615,1510,1471(aromaticframe),1388,1346,1328,1268,1173,1110,991,940,873,810,771,744cm-1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.88~7.85(m,2H,benzotriazole4,7-H),7.48(d,J=5.2Hz,1H,coumarin5-H),7.41~7.38(m,2H,benzotriazole5,6-H),6.83~6.78(m,2H,coumarin6,8-H),6.14(s,1H,coumarin3-H),4.98(t,J=6.7Hz,2H,coumarin-OCH2),4.11(t,J=5.8Hz,2H,benzotriazole-CH2),2.69~2.61(m,2H,coumarinOCH2CH2),2.40(s,3H,coumarin-CH3);ESI-MSm/z:358[M+Na]+,336[M+H]+;Anal.Calcd.forC19H17N3O3:C68.05,H5.11,N12.53;Found:C68.01,H5.11,N12.58?；衔?1c的合成參照化合物11a的制備方法,起始原料為7-(4-溴代丁氧基)-4-甲基香豆素(10c)(1.6g,5mmol)、1H-1,2,3-苯并三唑(0.7g,6mmol)、碳酸鉀(1.1g,8mmol)以及乙腈(30mL)。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-丙酮,v/v=3∶1),得白色固體7-(4-(1H-苯并三唑-1-基)丁氧基)-4-甲基香豆素(11c)1.4g,產(chǎn)率83%;熔點134~135℃;IR(KBr)ν:3092,3051(Ar-H),2964,2945,2883(CH2),1723(C=O),1610,1566,1510(aromaticframe),1442,1417,1390,1328,1266,1160,1011,978,960,917,884,802,723cm–1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.89~7.87(m,2H,benzotriazole4,7-H),7.50(d,J=7.5Hz,1H,coumarin5-H),7.40~7.37(m,2H,benzotriazole5,6-H),6.83~6.77(m,2H,coumarin6,8-H),6.13(s,1H,coumarin3-H),4.84(t,J=6.8Hz,2H,coumarin-OCH2),4.05(t,J=5.9Hz,2H,benzotriazole-CH2),2.39(s,3H,coumarinCH3),2.37~2.33(m,2H,coumarin-OCH2CH2),1.91~1.86(m,2H,benzotriazole-CH2CH2);ESI-MSm/z:372[M+Na]+,350[M+H]+;Anal.Calcd.forC20H19N3O3;C68.75,H5.48,N12.03;Found:C68.70,H5.51,N12.04?；衔?1d的合成按照化合物11a的制備方法,起始原料為7-(5-溴代戊氧基)-4-甲基香豆素(10d)(1.6g,5mmol)、1H-1,2,3-苯并三唑(0.7g,6mmol)、碳酸鉀(1.1g,8mmol)及乙腈30mL。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-丙酮,v/v=3∶1),得白色固體化合物7-(5-(1H-苯并三唑-1-基)戊氧基)-4-甲基香豆素(11d)1.5g,產(chǎn)率:82%;熔點121~123℃;IR(KBr)ν:3094,3041(Ar-H),2955,2941,2894(CH2),1711(C=O),1619,1576,1464(aromaticframe),1440,1409,1389,1301,1349,1288,1166,1011,995,953,875,832,772,710cm-1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.99~7.96(m,2H,benzotriazole4,7-H),7.49(d,J=6.3Hz,1H,coumarin5-H),7.41~7.38(m,2H,benzotriazole5,6-H),6.81~6.77(m,2H,coumarin6,8-H),6.13(s,1H,coumarin3-H),4.74(t,J=6.8Hz,2H,coumarinOCH2),4.01(t,J=5.7Hz,2H,benzotriazole-CH2),2.38(s,3H,coumarin-CH3),2.15~2.10(m,2H,coumarinOCH2CH2),1.87~1.82(m,2H,benzotriazole-CH2CH2),1.58~1.56(m,2H,coumarin-OCH2CH2CH2);ESI-MSm/z:386[M+Na]+,364[M+H]+;Anal.Calcd.forC21H21N3O3:C69.41,H5.82,N11.56;Found:C69.37,H5.83,N11.61?；衔?1e的合成按照化合物11a的制備方法,起始原料為7-(6-溴代己氧基)-4-甲基香豆素(10e)(1.7g,5mmol)、1H-1,2,3-苯并三唑(0.7g,6mmol)、碳酸鉀(1.1g,8mmol)及乙腈30mL。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-丙酮,v/v=3∶1),得白色固體7-(6-(1H-苯并三唑-1-基)己氧基)-4-甲基香豆素(11e)1.5g,產(chǎn)率80%;熔點111~112℃;IR(KBr)ν:3089,3062,3048(Ar-H),2940,2959,2760(CH2),1709(C=O),1614,1564,1510(aromaticframe),1444,1390,1367,1256,1106,1018,984,950,884,820,797,747,699,625cm–1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:8.01~7.98(m,2H,benzotriazole4,7-H),7.50(d,J=5.6Hz,1H,coumarin5-H),7.43~7.41(m,2H,benzotriazole5,6-H),6.81~6.76(m,2H,coumarin6,8-H),6.15(s,1H,coumarin3-H),4.73(t,J=7.7Hz,2H,coumarin-OCH2),4.01(t,J=5.2Hz,2H,benzotriazole-CH2),2.36(s,3H,coumarin-CH3),2.15~2.10(m,2H,coumarin-OCH2CH2),1.87~1.82(m,2H,benzotriazole-CH2CH2),1.58~1.56(m,4H,coumarin-OCH2CH2CH2,benzotriazoleCH2CH2CH2);ESI-MSm/z:408[M+Na]+,386[M+H]+;Anal.Calcd.forC22H23N3O3:C70.01,H6.14,N11.13;Found:C70.09,H6.11,N11.11?；衔?2a的合成參照化合物10a的制備方法,起始原料為7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、鄰二芐溴(3.1g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)以及丙酮30mL。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-石油醚,v/v=3∶2),得白色固體7-(2-(溴甲基)苯甲氧基)-4-甲基香豆素(12a)2.92g,產(chǎn)率81%;132~133℃;IR(KBr)ν:3109,3055(Ar-H),2967,2881,2780(CH2),1713(C=O),1655,1581,1500(aromaticframe),1461,1405,1362,1250,1180,1200,963,889,765,741,723,710cm–1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.51(d,J=7.7Hz,1H,coumarin5-H),7.39~7.31(m,4H,Ar3,4,5,6-H),6.89~6.85(m,2H,coumarin6,8-H),6.15(s,1H,coumarin3-H),4.89(s,2H,coumarin-OCH2),4.22(s,2H,Ar-CH2Br),2.41(s,3H,coumarin-CH3);ESI-MSm/z:361[M+2+H]+(81Br),359[M+H]+(79Br);Anal.Calcd.forC18H15BrO3:C60.18,H4.21;Found:C60.08,H4.24。2.4.2化合物10a,3-三唑的合成化合物12b的合成參照化合物10a的制備方法,起始原料為7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、間二芐溴(3.1g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)以及丙酮50mL。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-石油醚,v/v=3∶2),得白色固體7-(3-(溴甲基)苯甲氧基)-4-甲基香豆素(12b)2.92g,產(chǎn)率80%;熔點127~129℃;IR(KBr)ν:3091,3068(Ar-H),2980,2931,2792(CH2),1715(C=O),1626,1578,1547(aromaticframe),1434,1411,1332,1265,1154,1013,956,884,780cm–1;1HNMR(300MHz,CDCl3)δ:7.52(d,J=7.5Hz,1H,coumarin5-H),7.46~7.29(m,4H,Ar2,4,5,6-H),6.87~6.82(m,2H,coumarin6,8-H),6.14(s,1H,coumarin3-H),4.88(s,2H,coumarin-OCH2),4.11(s,2H,Ar-CH2),2.39(s,3H,coumarin-CH3);ESI-MSm/z:361[M+2+H]+(81Br),359[M+H]+(79Br);Anal.Calcd.forC18H15BrO3:C60.18,H4.21;Found:C60.06,H4.21?；衔?2c的合成參照化合物10a的制備方法,起始原料7-羥基-4-甲基香豆素(9)(1.6g,10mmol)、對二芐溴(3.1g,12mmol)、碳酸鉀(2.1g,15mmol)以及丙酮50mL,經(jīng)硅膠柱色譜析純化(洗脫劑:氯仿-石油醚,v/v=3∶2),得白色固體7-(4-(溴甲基)苯甲氧基)-4-甲基香豆素(12c)2.92g,產(chǎn)率79%;熔點117~118℃(文獻(xiàn)值:117~118℃)?；衔?3a的合成參照化合物11a的制備方法,起始原料7-(2-(溴甲基)苯甲氧基)-4-甲基香豆素(12a)(1.8g,5mmol)、1H-1,2,3-苯并三唑(0.7g,6mmol)、碳酸鉀(1.1g,8mmol)及乙腈30mL。經(jīng)硅膠柱色譜純化(洗脫劑:氯仿-丙酮,v/v=3∶1),得白色固體7-(2-((1H-苯并三唑-1-基)甲基)苯甲氧基)-4-甲基香豆素(13a)1.6g,產(chǎn)率81%;熔點154~155℃;IR(KBr)ν:3103,3064(