基于原球莖誘導(dǎo)和培養(yǎng)基選擇的西蘭花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

基于原球莖誘導(dǎo)和培養(yǎng)基選擇的西蘭花組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

蘭花是蘭科植物的總稱。蘭科植物是開花植物中最大的家族之一,而且是單子葉植物中最高度演化的一科,有6個(gè)亞科725屬25000余種,廣泛分布于全球各地。蘭花在中國(guó)約有170個(gè)屬1200余種,分布較為廣泛,幾乎全國(guó)各省都有。其中,青藏高原就有99屬474種及9個(gè)變種,廣東有71屬208種。蘭花不僅具有極高的觀賞價(jià)值,還具有獨(dú)特的食用和藥用價(jià)值。蘭花的根、葉、花、果、種子均有很高的藥用價(jià)值。印度人曾經(jīng)用蘭花EriopsisLindley治療唇瘡,同時(shí)其還可以舒緩牙齦和口腔黏膜的不適。不僅如此,蘭花對(duì)于現(xiàn)代社會(huì)人類高發(fā)病癥——癌癥也有較好的功效。因此,蘭花的組織培養(yǎng)及快速繁殖技術(shù)的發(fā)展以及基因功能的研究對(duì)促進(jìn)人類的健康及醫(yī)療事業(yè)都有著重要的意義。1蘭組培養(yǎng)的研究1.1褐化、葉片和種子外植體的選擇直接關(guān)系到原球莖的誘導(dǎo)。在組織培養(yǎng)中幼嫩部位產(chǎn)生褐化較輕,所以一般選取較幼嫩且生長(zhǎng)旺盛的部位。莖尖、葉片和種子是誘導(dǎo)原球莖的理想外植體來源。花瓣、萼片、子房、休眠芽、側(cè)芽、花梗節(jié)間段、根尖等均可作為外植體誘導(dǎo)出原球莖。1.1.1用單莖性蘭作為外植體的誘導(dǎo)莖尖是最早也是使用頻率最高的蘭花外植體,側(cè)芽應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。莖尖和側(cè)芽頂端分生區(qū)細(xì)胞的分裂能力強(qiáng),容易誘導(dǎo)出原球莖。大花蕙蘭(Cymbidium)、卡特麗亞蘭(Cattleya)、石斛蘭(Dendrobium)、墨蘭和建蘭等均成功用莖尖誘導(dǎo)出大量的原球莖。但對(duì)一些單莖性蘭花,如利蝴蝶蘭(Phalaeanopsis)、仙指甲蘭(Aerides)等用莖尖作為外植體有可能喪失母株,因此需要尋找其他外植體。經(jīng)過對(duì)莖尖及側(cè)芽的取材時(shí)間、部位及大小的研究,一般認(rèn)為帶1~2個(gè)葉原基的莖圓錐成活率高,中間部位側(cè)芽成活率也較高。1.1.2葉片誘導(dǎo)物葉片作為外植體既可減少對(duì)母株的傷害,取材又不受季節(jié)的限制,且數(shù)量多,是比較理想的外植體材料來源。但實(shí)驗(yàn)也表明雖然葉片也具有誘導(dǎo)出原球莖的能力,但成熟葉誘導(dǎo)出原球莖的能力極弱。幼葉誘導(dǎo)出原球莖的能力較成熟葉強(qiáng),但誘導(dǎo)率也很低,對(duì)于大花蕙蘭僅為3.3%左右。1.1.3非共生萌發(fā)法在自然條件下蘭花種子雖多,但由于其不具有發(fā)育完全的胚,且種皮致密、透性差或種皮中含有抑制物使種子很難萌發(fā)。自NoelBernared在1899年創(chuàng)立了蘭花種子共生萌發(fā)法后,研究者們接著發(fā)現(xiàn)大部分蘭花種子也可以通過無菌萌發(fā)的方式進(jìn)行,即非共生萌發(fā)。蘭花種子的非共生萌發(fā)已在蝴蝶蘭、石斛蘭、文心蘭等蘭花中取得成功。2005年中國(guó)科學(xué)院昆明研究所首次利用種子成功的誘導(dǎo)出云南野生拖鞋蘭和獨(dú)蒜蘭。由于種皮致密等原因,對(duì)部分蘭花種子的預(yù)處理也有利于蘭花種子的萌發(fā)。田梅生等用剪刀將四季蘭種皮剪破后種子的萌發(fā)率大大提高。1.1.4對(duì)含成類原球莖的植物誘導(dǎo)研究者們一般很少用花梗節(jié)間段作為外植體。魯雪華、郭文杰等在2002年成功地用蝴蝶蘭的花梗節(jié)間段誘導(dǎo)出原球莖,并且通過實(shí)驗(yàn)表明花梗節(jié)間段形成類原球莖的頻率明顯高于其它外植體(莖尖、根尖)。蘇加樂等也成功利用蝴蝶蘭的花梗節(jié)間段高效誘導(dǎo)出原球莖和增殖。1.1.5不同花蘭組織培養(yǎng)Stewart等用樹蘭(Epidendrum)的根首次成功地培養(yǎng)出了原球莖和從愈傷組織分化出1株苗。后來,根的誘導(dǎo)相繼在不同蘭花中獲得了成功。徐宏英等用大花蕙蘭的幼根成功地進(jìn)行組織培養(yǎng),來檢測(cè)其快速繁殖的影響因素。但由于蘭花的根部是共生菌根,所以根部作為外植體較難滅菌,在組織培養(yǎng)的過程中較容易污染。1.2基礎(chǔ)研究和添加材料1.2.1培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分蘭花的組織培養(yǎng)中常用的培養(yǎng)基為MS、VW、KnudsonC、Kyoto、White和它們的改良型,應(yīng)根據(jù)不同品種而選擇合適的培養(yǎng)基。如對(duì)于大花蕙蘭,MS,1/2MS,VW,KC均可應(yīng)用于原球莖的增殖,但以KC效果最好。MS培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分含量豐富,有利于增殖,不利于分化。White培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分含量低,有利于分化。本實(shí)驗(yàn)小組正在選取不同的培養(yǎng)基對(duì)春蘭和惠蘭進(jìn)行組織培養(yǎng)并取得一定進(jìn)展。蔗糖作為培養(yǎng)基的能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑,不同濃度對(duì)蘭花原球莖的生長(zhǎng)、分化影響較大。2%的蔗糖最有利于原球莖的生長(zhǎng),2%~3%的蔗糖促進(jìn)芽的形成,而根的分化和生長(zhǎng)則以5%的蔗糖最適合。無機(jī)鹽用量也不盡相同,如春蘭要求培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽量要少,墨蘭要求的量較大。培養(yǎng)基中使用的外源激素主要是生長(zhǎng)素類(如IAA、2,4-D和NAA)和細(xì)胞分裂素類(如BA、ZT和KT)。不同的蘭花、不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段所需激素的量和種類也不盡相同。1.2.2附加香蕉泥對(duì)原球莖增殖的影響適量的提取物,如在培養(yǎng)基中添加番茄汁、蛋白胨、酵母提取液、水解蛋白、蘋果汁、香蕉汁等可促進(jìn)蘭花種子的萌發(fā)。附加香蕉泥對(duì)原球莖的增殖有明顯的促進(jìn)作用。香蕉勻漿物在KC培養(yǎng)基和White培養(yǎng)基是最適合原球莖增殖的添加物。水解酪蛋白對(duì)于原球莖的增殖有明顯的促進(jìn)作用。另外,胰蛋白胨、酵母提取物和KC培養(yǎng)基一起使用對(duì)原球莖的增殖有促進(jìn)作用,但酵母提取物在White培養(yǎng)基上使用,對(duì)原球莖的增殖卻有抑制作用。1.3花的育種研究中國(guó)蘭花種質(zhì)資源非常豐富,但其主要是地生蘭中的小花品種,所以與引進(jìn)的洋蘭相比其市場(chǎng)占有量很小。目前對(duì)蘭花的研究主要集中在組織培養(yǎng)快速繁殖方面的研究,但蘭花人工育種方面的研究相對(duì)來說很少。四川農(nóng)科院的吳漢珠等進(jìn)行國(guó)蘭品種間的雜交研究獲得的優(yōu)良品種有十余個(gè)在中國(guó)蘭花博覽會(huì)上獲得金獎(jiǎng),這些優(yōu)良品種具有很好的市場(chǎng)。因此蘭花的雜交育種的廣泛研究與組織培養(yǎng)快速繁殖研究相結(jié)合必定會(huì)給中國(guó)蘭花產(chǎn)業(yè)帶來廣闊的市場(chǎng)與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。2蘭酶的科學(xué)研究2.1聚類分析結(jié)果應(yīng)用RAPD等分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)蘭屬品種間的親緣關(guān)系是近些年來蘭花分子系統(tǒng)學(xué)研究的重要手段,如梁紅建等用RAPD分析技術(shù)對(duì)19個(gè)中國(guó)蘭花進(jìn)行品種鑒定和分類研究。隨機(jī)引物擴(kuò)增條帶顯示每個(gè)蘭花品種都有其特有的擴(kuò)增帶可與其它品種區(qū)別。這種特異的條帶可作為一個(gè)品種的分子標(biāo)記而應(yīng)用于品種鑒定。RAPD對(duì)基因組的分析結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)果基本相符。李文等從55種10個(gè)堿基的隨機(jī)引物中篩選出4種引物,擴(kuò)增出93條多態(tài)性帶分析蘭屬的親緣關(guān)系。通過聚類分析表明,建蘭、墨蘭、春蘭的親緣關(guān)系較近,而春劍、寒蘭、獨(dú)占春和兔耳蘭與建蘭的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Cafasso等人利用位于葉綠體tRNALEU內(nèi)含子的微衛(wèi)星重復(fù)序列分析發(fā)現(xiàn)蘭花Anacamptispalustris的葉綠體是母本遺傳,為研究其親緣關(guān)系提供分子依據(jù)。蘭花染色體數(shù)目和大小變化的物種多樣性的形成與眾多因素有關(guān)。Cozzolino等認(rèn)為蘭花欺騙性的傳粉是其花和物種多樣性形成的一個(gè)關(guān)鍵因素。Otero等人注意到蘭花菌根間的相互作用對(duì)蘭花生物多樣性的影響是個(gè)不可忽略的因素。Moccia等利用核糖體ITS(internaltranscribedspacer)和AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)研究自然雜交和雜交頻率并結(jié)合傳統(tǒng)的方法(野外觀察等)發(fā)現(xiàn)傳粉者依賴的生殖隔離對(duì)食物欺騙性的蘭花發(fā)揮很小的作用。這個(gè)研究通過應(yīng)用和結(jié)合新舊生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)的研究方法為蘭花生物多樣性的研究開辟了新思路。2.2基因功能研究2.2.1蘭花的mads-前體基因家族含有MADS-box結(jié)構(gòu)域的植物轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子參與植物的再生和生長(zhǎng)變化過程。根據(jù)形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)分析發(fā)現(xiàn)花的四個(gè)結(jié)構(gòu)是由三個(gè)調(diào)節(jié)基因家族(ABC)來控制其發(fā)展變化的。研究擬南芥的B和C功能基因發(fā)現(xiàn)它們控制花瓣、雄蕊和心皮的發(fā)生,在結(jié)構(gòu)上是含有高度相似的MADS-box結(jié)構(gòu)域的基因。所有的B功能基因都屬于MADS-box結(jié)構(gòu)基因家族。這些B功能基因又可歸納為DEF/AP3-和GLO/PI-like兩組緊密相關(guān)的MADS-box結(jié)構(gòu)基因家族。蘭花是單子葉植物中高度演化的一科,與雙子葉植物不同的是所有蘭花都具有色的萼片。因?yàn)樘m花的萼片和花瓣具有相似的顏色和形狀,所以被統(tǒng)稱為花被片。蘭花的柱頭和雄蕊也形成一個(gè)高度特化的合蕊柱結(jié)構(gòu)。蘭花的這種復(fù)雜的花結(jié)構(gòu)及其發(fā)育過程和許多單子葉還有雙子葉植物一樣都受到MADS-box基因的功能調(diào)節(jié)。對(duì)蘭花的MADS-box結(jié)構(gòu)基因家族進(jìn)行研究,HSU等人發(fā)現(xiàn)金蝶蘭屬(Oncidium)OMADS3(AP3-like基因)調(diào)節(jié)蘭花的形成和發(fā)育。Tsa等人研究蝶蘭(Phalaenopsisequestris)發(fā)現(xiàn)PeMADS6(GLO/PI-likeMADS-box基因)與蘭花的花瓣形成和與花期的壽命還有子房的發(fā)育有關(guān)。BinGuo等人通過克隆鑒定及功能研究蘭花Phalaenopsis的一個(gè)PI-likecDNA發(fā)現(xiàn)其是決定蘭花花型的B族MADS-box基因PhPI15。轉(zhuǎn)基因煙草異常表達(dá)PhPI15出現(xiàn)雄性不育表型。不同的生物化學(xué)和分子事件如改變DNA甲基化的樣式、激活轉(zhuǎn)座因子或者染色體改造都能使高等植物的體細(xì)胞發(fā)生突變。蘭花的雜種再生植株的體細(xì)胞突變已有報(bào)道。Chen等人根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽EST應(yīng)用cDNA-RAPD和cDNA抑制差減雜交(SSH)分析出野生型和奇花突變株蝶蘭的雜種基因表達(dá)差異。應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)bZIP轉(zhuǎn)錄因子、DNA甲基化酶和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)在突變體被下調(diào),而植物生長(zhǎng)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶、TCP相關(guān)基因的表達(dá)被上調(diào)。SSH分析發(fā)現(xiàn)與花型對(duì)稱相關(guān)的TCP家族蛋白D20在突變體中被檢測(cè)到,這為更好地研究其在蝶蘭的花型改變發(fā)揮的生物學(xué)功能提供條件。2.2.2病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)研究非模式生物的功能基因組去揭示調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的改變對(duì)多樣性的影響在生物界一直是個(gè)很大的挑戰(zhàn)。研究非模式生物的困難在于巨大的基因組、很低的轉(zhuǎn)化效率、很長(zhǎng)的再生時(shí)間和生活周期,這些因素都導(dǎo)致非模式生物的功能基因組研究的進(jìn)展緩慢。蘭花的特殊傳粉和生態(tài)策略的多樣性為研究進(jìn)化關(guān)系和發(fā)生生物學(xué)提供了豐富的課題。但是大多蘭花基因組巨大而且生長(zhǎng)周期長(zhǎng)使得傳統(tǒng)的分子和遺傳學(xué)方法都不利于其功能基因組的研究。最近發(fā)展的病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS)被廣泛應(yīng)用于植物功能基因組的研究。Lu等人根據(jù)MADS-box基因的EST序列,利用蘭花花葉病毒構(gòu)建質(zhì)粒研究含有MADS-box結(jié)構(gòu)域的基因功能。將蘭花的MADS-box基因PeMADS6一段獨(dú)特的核苷酸序列(150bp)插入到pCymMV-pro60,結(jié)果PeMADS6在被嫁接的蝶蘭(Phalaenopsis)的表達(dá)被顯著抑制,但其他的MADS-box基因家族基因的表達(dá)變化沒有被察覺。而插入保守的500bp時(shí),PeMADS6和MADS-box基因家族的其他成員表達(dá)也都顯著的被抑制。在這些MADS-box基因被沉默的蘭花植株,其花的形態(tài)也發(fā)生了明顯的變化。原本需要一兩年才能檢測(cè)到的RNA變化用病毒誘導(dǎo)基因沉默的方法兩個(gè)月就能檢測(cè)到。VIGS技術(shù)的應(yīng)用對(duì)蘭花功能基因組的研究必定具有很大的推動(dòng)作用,也為其他用傳統(tǒng)分子和遺傳學(xué)方法不能研究的非模式植物功能基因組研究提供幫助。2.2.3大花推動(dòng)細(xì)胞基因突變研究蘭花的轉(zhuǎn)基因研究近年來也發(fā)展迅速。陳文輝等利用農(nóng)桿菌對(duì)蝴蝶蘭原球莖進(jìn)行了基因轉(zhuǎn)化研究,以NPTⅡ和GUS基因作標(biāo)記,初步建立了蝴蝶蘭的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因體系。Yang等將帶有NPTⅡ標(biāo)記基因的pKH200質(zhì)粒,通過基因槍對(duì)大花蕙蘭原球莖進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因研究,獲得了抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因植株,通過PCR分析,驗(yàn)證NPTⅡ基因存在于轉(zhuǎn)基因植株中。近兩年來基因疊加(genestacking)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的研究和應(yīng)用迅速發(fā)展,Chan等人首次將蘭花花葉病毒的衣殼蛋白cDNA(CP)和甜椒的類鐵氧還蛋白cDNA(Pflp)在Agrobacteriumtumefaciens的輔助作用下對(duì)蘭花原球莖進(jìn)行基因雙重轉(zhuǎn)化,成功篩選