一種多倍體病毒樣顆粒在黃島海珍品養(yǎng)殖場的分離和純化

一種多倍體病毒樣顆粒在黃島海珍品養(yǎng)殖場的分離和純化

孔惠德是中國北方沿海海鷗養(yǎng)殖的重要經(jīng)濟(jì)品種。目前，它是中國北方海上經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但隨著近年來病害的不斷加劇,養(yǎng)殖期櫛孔扇貝的大規(guī)模死亡現(xiàn)象頻繁發(fā)生,極大地威脅著這一產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此,國內(nèi)圍繞扇貝大規(guī)模死亡的致病因子及病原學(xué)的探討已引起養(yǎng)殖界各方的高度關(guān)注。2000年我們對山東省內(nèi)主要扇貝養(yǎng)殖海區(qū)開展了系統(tǒng)的病原學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查。通過病貝組織超薄切片的電鏡觀察,在病害高發(fā)期的病貝體內(nèi)大量發(fā)現(xiàn)一種球形病毒樣顆粒。在此基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步完成了該病毒粒子的分離和純化,現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報告如下。1材料和方法1.1單一殼生長特性具典型發(fā)病癥狀的櫛孔扇貝(殼高4.5～5.0cm)和健康的櫛孔扇貝(殼高7.5～8.0cm),分別于2000年7月和12月采自青島黃島海珍品養(yǎng)殖場。1.2蔗糖梯度的制備材料的處理:取扇貝消化腺加八倍體積的TEN緩沖液(0.05MTris-HCl,0.01MEDTA,0.4MNaCl,pH7.8),以FHX-1型高速分散器4000r·min-1冰浴研磨勻漿。初步提純(差速離心):將上述組織勻漿液于4°C3500g離心15min,取上清液,以TEN重懸沉淀物,反復(fù)離心2～3次。棄沉淀,合并上清液,加入蔗糖配制成終濃度為25%(w/w)的蔗糖墊,于4°C45000g離心1.5h。棄上清,以25%(w/w)蔗糖/TEN重懸沉淀物。進(jìn)一步提純(蔗糖密度梯度離心):以TEN配制蔗糖梯度(30%、35%、40%、45%、50%、55%,w/w),加鋪上述重懸液于離心管管頂。于4°C125000g離心4h,收取蔗糖梯度中乳白色或淺褐色沉淀帶,以TE(0.05MTris-HCl,0.01MEDTA,pH7.8)稀釋。于4°C45000g離心1.5h去除蔗糖,以TE重懸沉淀物,-70°C保存?zhèn)溆谩?.3病毒沉淀帶密度l取蔗糖密度梯度離心后的沉淀帶100μL,以阿貝折射儀測定病毒沉淀帶蔗糖溶液的折射率,根據(jù)蔗糖折射率與浮力密度的關(guān)系,計算出病毒沉淀帶的密度。1.4及其后解碳膜的反扣分別取差速離心和蔗糖密度梯度離心后的病毒重懸液,滴加在載玻片上,將覆有Formvar碳膜的銅網(wǎng)反扣在病毒懸液上,5min后,取下銅網(wǎng),晾干。滴加2%的磷鎢酸負(fù)染5min,用濾紙吸去多余的染液,室溫風(fēng)干,于JEM—1200EX電鏡下觀察并攝影。1.5細(xì)胞毒性檢測取瀕死櫛孔扇貝的消化腺、腎和腸,切成1mm3小塊,用2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定,系列乙醇脫水,Epon812滲透包埋,Ultracut-E型超薄切片機(jī)切片,經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后,于JEM-1200EX電鏡下觀察并攝影。2結(jié)果2.1外套腔內(nèi)統(tǒng)一檢查患病扇貝外觀癥狀主要表現(xiàn)為貝殼開閉緩慢無力,對外界刺激反應(yīng)遲鈍。去掉貝殼發(fā)現(xiàn)外套腔內(nèi)分泌物增多,積有少量淤泥,消化腺輕微腫脹,腎臟易剝離,外套膜向殼頂部收縮,外套眼失去光澤?；疾?yán)重的扇貝鰓絲輕度糜爛,腸道空或半空。青島地區(qū)發(fā)病高峰在7月底至8月初,扇貝出現(xiàn)上述癥狀2～3d后很快死亡,死亡率在90%以上。2.2病毒內(nèi)涵體的鑒定病貝組織超薄切片電鏡觀察顯示,在消化腺消化小管管間結(jié)締組織、腸粘膜下層結(jié)締組織以及腎小管管間結(jié)締組織分布有大量的病毒粒子(圖版-A,B,C)。該病毒粒子近似圓形,具有囊膜,囊膜內(nèi)可見均勻的高電子密度的核衣殼(圖版-A)。完整的病毒粒子直徑為130～170nm,核衣殼直徑為90～140nm,囊膜厚約7～10nm,囊膜與核衣殼之間的間距為13～16nm。病毒粒子以團(tuán)聚的方式存在于結(jié)締組織的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),核內(nèi)未見分布。在病變細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi),常常出現(xiàn)多個病毒粒子被一層質(zhì)膜所包被起來的現(xiàn)象,質(zhì)膜內(nèi)未見以特定晶格方式排列的蛋白基質(zhì),僅見病毒粒子、無囊膜的核衣殼以及空囊膜樣結(jié)構(gòu)(圖版-D)。在超薄切片中未發(fā)現(xiàn)包涵體存在。病毒侵染扇貝組織的病理變化主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi),出現(xiàn)細(xì)胞損傷時所形成的異常致密的板層狀結(jié)構(gòu),亦即髓鞘樣小體;線粒體腫大,嵴崩解、消失,基質(zhì)透明或呈絮狀(圖版-B)。2.3病毒粒子在蔗糖固定場中的浮力密度病貝組織勻漿液經(jīng)差速離心后,病毒粒子提純效果較差,沉淀物中同時混有大量無固定形態(tài)和結(jié)構(gòu)的雜質(zhì),可能為與病毒粒子質(zhì)量相近的細(xì)胞亞單位及碎片,但病毒粒子完整(圖版-F)。病毒粒子的形態(tài)近似圓形,直徑120～150nm,具囊膜,囊膜表面覆有長20～25nm的纖突,囊膜纖突致密地鑲嵌成規(guī)則的毛邊樣(圖版-G)。經(jīng)蔗糖密度梯度離心后,病毒沉淀中雜質(zhì)比較少,可以得到相對純凈的病毒粒子。提取的球形病毒在蔗糖梯度50%～55%范圍內(nèi)形成一條清晰的沉淀帶(圖1),此時以阿貝折射儀測得沉淀帶的折射率為1.4272,相應(yīng)的蔗糖濃度為53.3%(w/w),經(jīng)計算病毒粒子在蔗糖介質(zhì)中的浮力密度為1.2579g·(cm3)-1。密度梯度離心后的病毒粒子與差速離心后的病毒粒子形狀、大小一致,明顯的差別是病毒囊膜表面的纖突有部分缺失或完全缺失(圖版-E),這可能是由于病毒纖突與病毒囊膜連結(jié)不緊密以至于在提純過程中造成的結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。健康扇貝組織勻漿液經(jīng)差速離心和蔗糖密度梯度離心后,在蔗糖介質(zhì)中病毒粒子出現(xiàn)的相應(yīng)范圍內(nèi)未見到沉淀帶(圖1)。3病毒的純化與純化病貝組織超薄切片電鏡觀察表明,在病變細(xì)胞胞質(zhì)區(qū)域,病毒粒子以聚團(tuán)的方式聚集形成“簇”,病毒簇由質(zhì)膜包被形成有別于胞質(zhì)細(xì)胞器的囊泡樣結(jié)構(gòu),其內(nèi)分布有大量裝配好的病毒粒子、核衣殼以及囊膜材料。由此斷定,病毒的發(fā)生基質(zhì)應(yīng)是在細(xì)胞質(zhì)中。在大多數(shù)無脊椎動物病毒中,特別是某些昆蟲病毒所形成的包涵體,在電鏡下是一些具備蛋白質(zhì)結(jié)晶性質(zhì)的有形實(shí)體,其中包被著裝配完整的病毒粒子。而我們觀察到的是包被著大量球形病毒粒子的囊泡樣結(jié)構(gòu),其內(nèi)并無以特定晶格方式排列的蛋白質(zhì)基質(zhì)。因此,這種球形病毒極可能是一種無包涵體的病毒。囊泡樣結(jié)構(gòu)形成的區(qū)域是病毒合成與裝配最為活躍的場所,可能是病毒粒子形成的發(fā)生基質(zhì)。病毒提純液的負(fù)染電鏡觀察顯示,在病毒囊膜表面覆有囊膜蛋白突起,亦即纖突。我們推測,這種結(jié)構(gòu)在病毒侵染宿主細(xì)胞的過程中起著重要作用,它很可能參與病毒粒子對宿主細(xì)胞受體的識別、吸附與侵入。細(xì)胞培養(yǎng)通常是獲取大量純凈病毒的理想方法,但由于目前尚未建立貝類組織培養(yǎng)細(xì)胞系,人們只能直接從感染組織內(nèi)分離純化病毒。差速離心與密度梯度離心是常用的病毒純化方法,差速離心法先以低速離心去除較大的細(xì)胞碎塊以及其它較大雜質(zhì),再以高速離心沉淀病毒。高速離心時,我們在病毒懸液中加入適量蔗糖制成“蔗糖墊”,用以去除部分質(zhì)量較輕的細(xì)胞碎片及細(xì)胞亞單位。但僅用差速離心法來純化病毒,純化的效果較差,大量質(zhì)量與病毒粒子相近的細(xì)胞碎片和細(xì)胞亞單位與病毒粒子同時沉淀。通過密度梯度離心可以使病毒粒子與其它雜質(zhì)分離開,質(zhì)量較輕的雜質(zhì)停留在上層介質(zhì)內(nèi),質(zhì)量較重的雜質(zhì)繼續(xù)沉降在相應(yīng)密度的介質(zhì)層內(nèi),從而使病毒得以進(jìn)一步純化。因此,采用差速離心法與密度梯度離心法相結(jié)合的提純技術(shù),可獲得比較純凈的病毒樣品。另外,本文所測得的病毒浮力密度可以為差速離心、密度梯度離心轉(zhuǎn)速與離心時間設(shè)定以及蔗糖密度梯度設(shè)定范圍提供參考與借鑒。病貝組織超薄切片和負(fù)染電鏡觀察表明,櫛孔扇貝球形病毒是一種囊膜表面具纖突、形態(tài)較大的病毒粒子。在提純過程中,纖突極易脫落或缺失。在病料樣品不新鮮或保存不當(dāng)時,很難得到完整的病毒粒子。因此,在病毒提純時應(yīng)使用新鮮病料,并避免反復(fù)凍融。此外,過高的離心力,緩沖液滲透壓的劇烈變化都會影響病毒的完整性,要綜合考慮離心的時間和離心力的大小,采用適宜滲透壓的緩沖溶液,并盡可能在低溫下研磨與離心。貝類病毒病的研究始于70年代,迄今已見報道的貝類病毒主要有虹彩病毒、皰疹病毒和乳多空病毒,感染的貝類宿主主要是牡蠣,包括長牡蠣(Crassostreagiges)、歐洲扁牡蠣(Ostreaedulis)、扁牡蠣(Tiostreachilensis)、大珠母貝(Pinctadamaxima)。王斌等在皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)血細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種具有囊膜但無囊膜纖突的球形病毒,病毒粒子直徑為90～140nm。我們發(fā)現(xiàn)的病毒是在扇貝結(jié)締組織細(xì)胞質(zhì)中裝配形成的有囊膜且明顯有囊膜纖突的球形病毒粒子,病毒粒子直徑為130～