兩種血蜱對(duì)萊姆病螺旋體保持能力的比較

兩種血蜱對(duì)萊姆病螺旋體保持能力的比較

lagoon病是一種由感染水稻的自然疾病。在世界30多個(gè)國(guó)家，特別是在美國(guó)，每年報(bào)告3萬多人，并被稱為“第二愛得病”（b格杜埃特，1982）。我國(guó)自1986年發(fā)現(xiàn)海林縣存在萊姆病自然疫源地以后(Aietal.,1988),先后證實(shí)我國(guó)26個(gè)省、市、自治區(qū)存在萊姆病自然疫源地(萬康林等,1998),年發(fā)病例至少萬余。蜱是萊姆病傳播的主要媒介,我國(guó)只有全溝硬蜱IxodespersulcatusSchulze由自然感染(Aietal.,1988)、經(jīng)卵傳播(杜勇等,1990)和經(jīng)期傳播(Sunetal.,2002c)等證據(jù)證實(shí)為我國(guó)北方林區(qū)萊姆病的主要傳播媒介,但此蜱僅分布于秦嶺以北的山地林區(qū),從分布區(qū)系來看,它不是我國(guó)南方林區(qū)萊姆病的傳播媒介。然而我國(guó)浙江、福建、貴州、江蘇等南方省區(qū)存在著萊姆病感染人群(萬康林等,1998),并且一些優(yōu)勢(shì)蜱種如長(zhǎng)角血蜱HaemaphysalislongicornisNeumann、越原血蜱H.yeniToumanoff、粒形硬蜱IxodesgranulatusSupino、銳跗硬蜱I.acutitarsus(Karsch)等多種蜱已分離或檢測(cè)到萊姆病螺旋體。但這些不足以說明這些蜱種的媒介地位,還需要實(shí)驗(yàn)傳播能力、生態(tài)學(xué)等方面的證據(jù)。蜱類每一發(fā)育期只有一次吸血,因而經(jīng)期傳播(即經(jīng)過不同發(fā)育期后亦攜帶感染性病原體)率比經(jīng)卵傳播率高,是蜱在萊姆病傳播中發(fā)揮作用的主要傳播方式。感染和經(jīng)期傳播實(shí)驗(yàn)可為分析蜱種作為萊姆病媒介的可能性提供必要的依據(jù)(Laneetal.,1991)。因此,我們以我國(guó)南方林區(qū)分布且對(duì)人畜有很強(qiáng)的攻擊性的優(yōu)勢(shì)蜱種中華硬蜱IxodessinensisTeng、越原血蜱和青海血蜱HaemaphysalisqinghaiensisTeng為基礎(chǔ),探討它們傳播萊姆病螺旋體的可能性,以明確它們?cè)谌R姆病傳播中的地位和作用。1材料和方法1.1血蚤、萊姆病螺旋體菌株中華硬蜱于2001年采自浙江臨海和福建武夷山林區(qū);越原血蜱于2001年采自福建武夷山林區(qū);青海血蜱于2002年采自甘肅省甘南藏族自治州卓尼縣林區(qū)。萊姆病螺旋體菌株BorreliagariniiCHNM4于1999年自內(nèi)蒙古采集的全溝硬蜱中分離而得(孫毅等,2002a)。昆明小鼠(簡(jiǎn)稱KM鼠)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2方法1.2.1烷氧基苯磺酸鹽5-四甲基氨甲基中華硬蜱、越原血蜱和青海血蜱非感染幼蜱種群的建立參照孫毅等(2002b)的方法進(jìn)行,以此幼蜱種群刺叮正常昆明小鼠蛻化形成的若蜱為非感染若蜱種群。1.2.2萊姆病人工床上模型的構(gòu)建人工宿主動(dòng)物模型的建立參照孫毅等(2002b)的方法進(jìn)行,以耳組織分離為陽(yáng)性的KM鼠為人工宿主動(dòng)物模型。1.2.3小鼠蛻化、分離和pcr檢測(cè)以中華硬蜱、越原血蜱和青海血蜱的非感染種群分別攻擊陽(yáng)性昆明小鼠,待飽血后,置于底部墊有濕潤(rùn)細(xì)沙和濾紙的試管中,然后幼蜱和若蜱分別于飽血后每隔2日采用PCR和分離的方法進(jìn)行檢測(cè)并觀察蜱的存活與蛻皮情況,直至全部蛻化。待其全部蛻化后,分成兩部分,一部分若蜱于蛻化后1個(gè)月內(nèi)采用分離和PCR方法檢測(cè),另一部分若蜱攻擊正常昆明小鼠,以叮咬小鼠時(shí)間大于72h為有效攻擊,每只昆明小鼠獲得有效攻擊蜱數(shù)不低于5,逐日觀察被叮咬小鼠的體表癥狀,28天后采小鼠心血致死,取少量心血進(jìn)行分離培養(yǎng),并解剖觀察,取脾臟、膀胱、耳葉組織進(jìn)行分離和PCR檢測(cè),以同一組織塊兩種檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性者為陽(yáng)性結(jié)果。飼養(yǎng)條件:(25±1)℃,RH(95±5)%,光周期12L∶12D。1.2.4動(dòng)物組織dna提取pcr檢測(cè)將蜱縱切為兩半,分別進(jìn)行分離和PCR檢測(cè),以兩種檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性者為陽(yáng)性結(jié)果。動(dòng)物組織也分成兩部分,一部分采用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA模板后進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè),另一部分采用分離培養(yǎng)方法進(jìn)行檢測(cè)。具體的分離和PCR檢測(cè)方法參照Sun等(2002c)進(jìn)行。1.2.5羅氏病螺旋體傳播的穩(wěn)定性將實(shí)驗(yàn)中的陽(yáng)性標(biāo)本,采用16SrRNA通用引物進(jìn)行擴(kuò)增和序列測(cè)定(孫毅等,2002a)1.2.6數(shù)據(jù)分析采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。2結(jié)果與分析2.1中國(guó)硬蜱感染和萊姆病螺旋體可能性2.1.1幼象：將中國(guó)硬蜱與非感染幼象物種的唾液混合，并在一天內(nèi)獲得對(duì)萊姆病軸的感染，每次都可以檢測(cè)到自己是否感染了萊姆病螺旋體。結(jié)果表1表明，艾滋病毒的幼象可以通過與陽(yáng)性km大鼠一起獲取萊姆病螺旋體。盡管檢測(cè)到萊姆病螺旋體的陽(yáng)性率不同，但從滿血后到轉(zhuǎn)化為陽(yáng)性時(shí)，陽(yáng)性率和分離結(jié)果可以得到很好的不同，分離和檢測(cè)結(jié)果之間沒有顯著差異。這表明蠕蟲在這一時(shí)期曾運(yùn)輸過生活的萊姆病螺旋體。萊姆病螺旋體可以存在于中國(guó)硬蜱中，直到它轉(zhuǎn)化為像蘑菇。通過這種方法，可以獲得由非標(biāo)準(zhǔn)狗移植的陽(yáng)性率為50%27天或55.6%30天。將吞咽進(jìn)白色老鼠的完整血分解成藍(lán)色km大鼠的所有分離結(jié)果均為陰性。事實(shí)證明，中國(guó)硬蜱可以通過吸收血液、消化、轉(zhuǎn)化和吸收血液，并將敏感小鼠的血液傳播給成熟的km大鼠2.1.2不同分離方法對(duì)萊姆病螺旋體的感染情況采用非感染幼蜱攻擊已感染的KM鼠,獲得飽血幼蜱。從飽血脫落后起,在第1、3、6、9、12、15天檢測(cè)蜱感染萊姆病螺旋體的情況。結(jié)果表明,越原血蜱、青海血蜱叮咬陽(yáng)性KM鼠后,均可獲得萊姆病螺旋體,陽(yáng)性率分別為90.0%(27/30)、55.0%(33/60)。隨著飽血后時(shí)間的變化,蜱體內(nèi)的萊姆病螺旋體逐漸崩解,陽(yáng)性率降低,至第9天,感染率分別降低到13.3%(4/30)和1.7%(1/60),此后,自第12天至第15天,越原血蜱和青海血蜱蛻化為若蜱后,所有檢測(cè)結(jié)果均呈陰性;蛻化為若蜱3天后,再進(jìn)行檢測(cè),仍未得到陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果(圖2,表2)。而分離方法檢測(cè)的結(jié)果則與PCR方法類似,越原血蜱只在飽血后第1～6天內(nèi)有陽(yáng)性分離結(jié)果,第1天陽(yáng)性率為93.3%(28/30),至第6天,只有6只分離結(jié)果呈陽(yáng)性(n北京=30)(圖2);至于青海血蜱,也只在飽血后第1～6天可從飽血內(nèi)分離到螺旋體,陽(yáng)性率分別為51.7%(31/60)、20.0%(12/60)和13.3%(8/60)。此后所有分離檢測(cè)結(jié)果均為陰性(表2)。以此兩種蜱蛻化形成若蜱攻擊敏感KM鼠,也未獲得陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。叮咬空白KM鼠的飽血越原血蜱和青海血蜱的幼蜱在飽血、蛻皮、再吸血過程的所有分離和檢測(cè)結(jié)果均為陰性?？梢钥闯?越原血蜱和青海血蜱的幼蜱雖可以感染但不具備經(jīng)期傳播萊姆病螺旋體的能力。采用類似的方法對(duì)越原血蜱、青海血蜱各自的若蜱進(jìn)行感染和經(jīng)期傳播實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,它們各自若蜱雖可以感染但仍不具備經(jīng)期傳播萊姆病螺旋體至成蜱的能力。若蜱的陽(yáng)性感染率以及對(duì)萊姆病螺旋體的保持能力同幼蜱基本一致,若蜱也可以通過吸血感染萊姆病螺旋體但不能跨越蛻皮階段(圖2,表2)。其中,越原血蜱飽血后18天蛻化為成蜱,在飽血后1～6天內(nèi)可以分離到萊姆病螺旋體,陽(yáng)性PCR檢測(cè)也只能持續(xù)到飽血后1～9天,此后所有檢測(cè)均未獲得陽(yáng)性結(jié)果(圖2);與越原血蜱相比,青海血蜱通過吸血獲得萊姆病螺旋體的陽(yáng)性感染率較低,僅為70.0%(28/40,PCR)和52.5%(21/40,分離);青海血蜱的蛻皮期較長(zhǎng)(21天),相對(duì)而言,青海血蜱對(duì)萊姆病螺旋體的保持能力不及越原血蜱(表2)。另外,以蛻化后的此兩種蜱的成蜱攻擊敏感KM鼠,也未獲得陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。同時(shí),空白對(duì)照組內(nèi)若蜱至成蜱期間所有檢測(cè)結(jié)果均為陰性?？梢?越原血蜱和青海血蜱若蜱也不具備經(jīng)期傳播的能力。2.3srdna擴(kuò)增在經(jīng)期實(shí)驗(yàn)傳播過程中,對(duì)培養(yǎng)螺旋體、KM鼠、飽血幼蜱、飽血若蜱所感染萊姆病螺旋體的16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增,獲得了大小一致的擴(kuò)增片段,為806bp;對(duì)這些片段序列進(jìn)行同源性分析,結(jié)果它們的序列完全一致,說明中華硬蜱、越原血蜱和青海血蜱等實(shí)驗(yàn)中所檢測(cè)到的均為伯氏疏螺旋體,而非其它微生物。3子硬烷復(fù)合組我國(guó)南方地區(qū)雖從人群血清學(xué)角度證明了萊姆病自然疫源地的存在,但其主要媒介和宿主動(dòng)物尚未明確。一些優(yōu)勢(shì)蜱種如長(zhǎng)角血蜱(沈壯等,1993)、二棘血蜱H.bipsinosa、具角血蜱H.cornigera(即臺(tái)灣角血蜱H.cornigerataiwanas)(郭衍等,1998)、森林革蜱Dermacentorsilvarum、嗜群血蜱H.concinna(張德才等,1996)、西藏血蜱H.tibetebsis(張泮河等,1996)、日本血蜱H.japonica(田萬春等,1995)、越原血蜱、青海血蜱(Zhangetal.,1996)、粒形硬蜱(潘亮等,1992)、銳跗硬蜱(王成全等,1999)等已分離或檢測(cè)到萊姆病螺旋體。然而,蜱類對(duì)萊姆病螺旋體的自然感染并不能說明該蜱可以傳播萊姆病螺旋體,尚需要經(jīng)期傳播能力的證據(jù)。例如,蚊子和鹿蠅雖感染有萊姆病螺旋體,但不具備傳播能力,不能作為萊姆病媒介(MagnarelliandAnderson,1988)。經(jīng)期傳播是蜱在萊姆病傳播中發(fā)揮作用的主要傳播方式,因此感染和經(jīng)期傳播實(shí)驗(yàn)是明確蜱種作為萊姆病的媒介可能性的必要手段。利用這種方法,硬蜱屬四個(gè)主要蜱種全溝硬蜱、篦子硬蜱I.ricinusL.、太平洋硬蜱I.pacificusL.和肩板硬蜱I.scapularisSay(=I.dammini)被確認(rèn)作為萊姆病傳播媒介(Laneetal.,1991),并且它們均由于形態(tài)特征的類似被歸屬于篦子硬蜱復(fù)合組。同時(shí),該復(fù)合組以外的一些蜱種如齒形硬蜱I.dentatusMarx(Oliveretal.,1996)、微小硬蜱I.minorNeumann(Banksetal.,1998)、鼠形硬蜱I.murisBishoppandSmith(Dolanetal.,2000)、庫(kù)氏硬蜱I.cookeiPackard(Halletal.,1991)和葉氏硬蜱I.jellisoniCooleyandKohls(HubbardandCann,1998)等均被證實(shí)具備經(jīng)期傳播萊姆病螺旋體能力;與此相反,一些蜱種如硬蜱屬中卵形硬蜱I.ovatus(MinoruandMiyamoto,1994)、革蜱屬中的網(wǎng)紋革蜱Dermacentorreticulates(Kahletal.,1992)、安氏革蜱D.andersoniStiles(Laneetal.,1994;Dolanetal.,1997)、變異革蜱D.variabilis(Say)(PiesmanandSinsky,1988;SanderandOliver1995;PiesmanandSinsky,1997)、西方革蜱D.occidentalisMarx(KramerandBeesley,1993;Laneetal.,1994)、森林革蜱和草原革蜱D.nuttalliOlenev(孫毅等,2002d)以及血蜱屬中的嗜群血蜱(Sunetal.,2002c)、褐黃血蜱H.flava(Kahletal.,1992)、日本血蜱(MinoruandMiyamoto,1994)、刻點(diǎn)血蜱H.punctata(Angelovetal.,1996)和長(zhǎng)角血蜱(Sunetal.,2002c)等均因不具備經(jīng)期傳播萊姆病螺旋體的能力,作為萊姆病媒介的可能性被否定。伯氏疏螺旋體可分為4個(gè)基因種(Genomicspecies),即分布于北美洲的狹義伯氏疏螺旋體Borreliaburgdorferisensustricto、分布?xì)W亞大陸的B.garinii和愛氏疏螺旋體B.afzelii以及日本分離的日本疏螺旋體B.japonica等(Ishiguroetal.,2000),這些基因種的劃分標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)為他們的致病性以及感染病人的臨床癥狀所證實(shí)(Laneetal.,1991)。我國(guó)分離的萊姆病螺旋體菌株,除極少數(shù)同北美菌株有共同特征外,大部分菌株同歐洲菌株相似。其中B.garinii為優(yōu)勢(shì)種,占67.45%,其次為B.afzelii,占22.72%,也有少數(shù)菌株為B.burgdorferis.s.,另外還存在一些目前不能分類的菌株(萬康林等,1998;Lietal.,1998)。本實(shí)驗(yàn)采用的是由全溝硬蜱分離的B.garinii,它在我國(guó)廣泛分布,具有一定的代表性。同時(shí),KM鼠感染后其后足的膝關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)明顯腫脹,也說明其典型的致病性特點(diǎn)(孫毅等,2002b)。本研究旨在通過實(shí)驗(yàn)感染和傳播研究,分析我國(guó)南方主要蜱類中華硬蜱、越原血蜱、青海血蜱作為萊姆病媒介的可能性。結(jié)果表明,越原血蜱和青海血蜱不具備經(jīng)期傳播萊姆病螺旋體B.gariniiCHNM4的能力,不可能是萊姆病的傳播媒介。以前在越原血蜱和青海血蜱體內(nèi)檢測(cè)到萊姆病螺旋體,可能有以下兩個(gè)原因:(1)檢測(cè)到的螺旋體同目前發(fā)現(xiàn)的萊姆病螺旋體具有一定同源性,檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為陽(yáng)性或交叉陽(yáng)性結(jié)果,如安氏革蜱D.anderson分離到的螺旋體B.andersoni和變異革蜱D.variabilis分離到螺旋體B.lonestari等(Kocanetal.,1992);(2)越原血蜱和青海血蜱與某未知媒介共同吸血,媒介蜱種所產(chǎn)生的螺旋體調(diào)控物質(zhì)進(jìn)入宿主,再隨吸血進(jìn)入越原血蜱和青海血蜱中腸,蒂進(jìn)了萊姆病螺旋體在體內(nèi)的存活和感染,如變異革蜱和肩板硬蜱共同吸血可以促進(jìn)對(duì)變異革蜱對(duì)萊姆病螺旋體的保持能力(Godenetal.,1997)。本研究中,中華硬蜱具備經(jīng)期傳播的能力,作為我國(guó)南部林區(qū)萊姆病傳播媒介的可能性很大。我國(guó)的中華硬蜱在形態(tài)特征上同篦子硬