鎘積累模式不同的兩個(gè)基因型煙草品種的積累特征

鎘積累模式不同的兩個(gè)基因型煙草品種的積累特征

重金屬是影響葉片安全的重要因素之一。在重金屬中，d具有毒性高、污染常見(jiàn)。易將其積累在葉片中，發(fā)芽強(qiáng)烈，并且具有高度的隨機(jī)性，容易對(duì)人體造成損害?？刂茻煵葜破分蠧d的含量在減輕煙草重金屬對(duì)人體危害方面意義重大。煙草制品中的Cd主要來(lái)源于煙葉生產(chǎn)過(guò)程,土壤是其主要途徑之一?？刂艭d從土壤向煙草轉(zhuǎn)移的過(guò)程是控制煙葉中Cd含量的有效方法。國(guó)內(nèi)外許多科技工作者研究了影響Cd從土壤向煙草遷移的因子,如:土壤理化性質(zhì)、肥料、其他金屬元素、陪伴陰離子Cl-等,相應(yīng)也提出了一些控制措施。煙草對(duì)Cd的吸收存在顯著的基因型差異,普通煙草(N.tabacum)和黃花煙草(N.rustica)有著不同的鎘積累特性,前者表現(xiàn)為葉片和根系富集,而后者則為根系富集。對(duì)其他作物的研究發(fā)現(xiàn),Cd的富集與其在亞細(xì)胞水平上的分布有關(guān),但關(guān)于黃花煙草和普通煙草對(duì)Cd的不同富集特征與其細(xì)胞內(nèi)Cd的亞細(xì)胞分布特點(diǎn)間的關(guān)系尚不清楚。因此,以Cd積累特征不同的兩種煙草類型為對(duì)象,比較Cd在兩類煙草中的亞細(xì)胞分布和化學(xué)形態(tài)的差異,探究產(chǎn)生煙草Cd積累基因型差異的原因,為利用生物技術(shù)控制煙葉中Cd的含量提供依據(jù)。1材料和方法1.1水培營(yíng)養(yǎng)液和cd溶液供試煙草品種選用普通煙草品種K326和黃花煙草品種N.rustica。水培營(yíng)養(yǎng)液采用1/4濃度的Hoagland完全營(yíng)養(yǎng)液。Cd溶液以分析純CdCl2·5/2H2O配制。樣品消解所用HNO3,H2O2均為優(yōu)級(jí)純。1.2培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)煙草種子經(jīng)浸泡、滅菌、消毒后于28℃黑暗條件下催芽,發(fā)芽后移入蛭石培養(yǎng)基中培養(yǎng)至6葉1心期,選取大小一致的煙苗,用去離子水沖洗干凈后移至營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)1周后備用。煙苗培養(yǎng)所用容器為體積1.5L的塑料盆,每盆定植6株。煙苗培養(yǎng)在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行,控制條件為光照16h/d,溫度28℃(晝)/18℃(夜),相對(duì)濕度70%。培養(yǎng)期間每3d更換1次營(yíng)養(yǎng)液,營(yíng)養(yǎng)液用0.1mol·L-1NaOH或0.1mol·L-1HCl調(diào)節(jié)溶液pH至6.0左右。1.3煙株根系的取樣試驗(yàn)設(shè)置低Cd(1μmol/L)和高Cd(50μmol/L)兩個(gè)處理水平,每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。煙苗在營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)1周后進(jìn)行Cd處理,除Cd處理外,培養(yǎng)條件與前期相同,Cd處理10d后取樣。取樣時(shí),煙株根系先用自來(lái)水沖洗,然后置于20mmol/LNa2-EDTA溶液中交換20min以除去根系表面吸附的Cd2+,最后用去離子水沖洗干凈,吸水紙吸干表面水分后分根、莖、葉取樣。取樣所得根、莖、葉材料,一部分立即置于-20℃保存,供亞細(xì)胞組分和賦存形態(tài)測(cè)定;另一部分于70℃下烘干至恒重,稱量、磨碎用于煙株Cd全量測(cè)定。1.4分析1.4.1亞硝酸根的分離采用差速離心法進(jìn)行亞細(xì)胞組分分離,具體操作參照周小勇等的方法。1.4.2分離并提取細(xì)胞內(nèi)的cd化學(xué)形態(tài)采用化學(xué)試劑逐步提取法,具體操作參照于方明的方法。1.5cd含量的測(cè)量1.5.1混合酸微波消解hno3-h12的制備稱取0.1g粉碎干樣,用5:2(體積比)的HNO3-H2O2混合酸微波消解,消解完全后用超純水定容,Cd含量由石墨爐原子光譜儀(PerkinElmer800)測(cè)定。1.5.2評(píng)價(jià)沉淀和殘?jiān)衏的含量沉淀和殘?jiān)M分于80℃下水浴蒸干后,按照植株Cd含量測(cè)定方法測(cè)定。1.5.3上清液體成分的cd含量1.6數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖,采用SPSS16.0軟件LSD法進(jìn)行差異顯著性分析。2結(jié)果與討論2.1cd對(duì)煙草幼苗生長(zhǎng)的影響圖1顯示,隨著Cd處理濃度的升高,2個(gè)煙草品種生物量均呈降低趨勢(shì)。Cd處理濃度為50μmol/L時(shí),K326生物量顯著低于對(duì)照和1μmol/LCd處理,N.rustica的生物量各處理間差異不顯著。說(shuō)明1μmol/L和50μmol/L的Cd處理對(duì)兩種煙草幼苗生長(zhǎng)均有一定的抑制作用,隨著Cd濃度的升高抑制作用增強(qiáng),且對(duì)K326的抑制程度大于N.rustica。50μmol/LCd處理時(shí),兩種煙草均表現(xiàn)出明顯毒害癥狀,葉片萎黃,植株矮小,根系變?yōu)闇\紅棕色,K326的毒害程度大于N.rustica,與生物量的降低趨勢(shì)一致。2.22n.關(guān)于cd根系積累特征由圖2看出,在營(yíng)養(yǎng)液中Cd濃度為1μmol/L時(shí),2個(gè)基因型煙草表現(xiàn)出不同的Cd積累特性。K326葉片中Cd含量是N.rustica的1.82倍,但N.rustica根系Cd含量是K326的7.80倍,K326和N.rustica中Cd含量的根葉比分別為1.12和16.03,黃花煙草表現(xiàn)出明顯的Cd根系積累特征,與前人研究結(jié)果一致。在50μmol/LCd處理時(shí),2種煙草葉片和根系中Cd含量均顯著提高,尤以K326根系Cd含量提高最為明顯,2個(gè)基因型煙草均呈現(xiàn)出Cd的根系積累特性,說(shuō)明將大部分的重金屬積累在根系是作物抵御重金屬毒害的一種機(jī)制。2.32cd的累積特征表1顯示,在2個(gè)Cd處理水平下,兩類煙草中Cd在各亞細(xì)胞組分中的分布趨勢(shì)相似,根系和葉片各亞細(xì)胞組分中的含量由高到低依次為:可溶性組分、細(xì)胞壁組分、細(xì)胞核和葉綠體組分、線粒體組分,所有的處理及部位中可溶性組分Cd的含量均顯著高于其他組分。Cd濃度為50μmol/L時(shí),細(xì)胞壁組分Cd的含量增加,顯著高于細(xì)胞器和細(xì)胞核組分。說(shuō)明2個(gè)基因型煙草根系和葉片中的Cd主要積累于以胞液為主的可溶組分中,隨著Cd處理濃度的升高,細(xì)胞壁組分結(jié)合Cd的能力明顯增強(qiáng),細(xì)胞器和細(xì)胞核組分中Cd積累較少。雖然2個(gè)基因型煙草各亞細(xì)胞組分中Cd含量的大小趨勢(shì)一致,但不同組分對(duì)Cd的結(jié)合強(qiáng)度存在一定的差異。由圖3看出,Cd處理濃度為1μmol/L時(shí),N.rustica根系中可溶組分結(jié)合的Cd占總量的73.50%,高于K3266.97百分點(diǎn),葉片中可溶組分結(jié)合的Cd卻低于K3269.28百分點(diǎn),為總量的47.21%。2個(gè)基因型煙草中Cd在可溶組分結(jié)合的比例與其相應(yīng)部位Cd積累總量的趨勢(shì)一致。說(shuō)明低濃度Cd處理下液泡對(duì)Cd的截留可能是造成兩個(gè)基因型煙草不同Cd累積特征的影響因素之一。Cd處理水平提高到50μmol/L時(shí),K326葉片和根系中細(xì)胞壁組分結(jié)合Cd的比例顯著上升,根系中由1μmol/L時(shí)的17.32%上升到31.22%,葉片中由26.24%上升到86.64%;同時(shí)可溶組分的含量明顯下降,根系中由1μmol/L時(shí)的66.53%下降到46.19%,葉片中由56.49%下降到31.80%。但是N.rustica根系和葉片中Cd在各組分中的分配比例沒(méi)有明顯變化,仍以可溶組分的結(jié)合為主。說(shuō)明高濃度Cd處理下,K326細(xì)胞壁對(duì)Cd的固持作用得到增強(qiáng),細(xì)胞壁固持也成為其富集Cd的影響因素之一,這與一些Cd超富集植物研究結(jié)果相一致?？梢?jiàn),造成N.rustica根系積累Cd的主要原因與其根系中液泡對(duì)Cd的截留能力有關(guān),而造成K326葉片中Cd積累的原因與液泡和細(xì)胞壁的截留均有關(guān)。2.42cd的賦存形態(tài)表2和圖4結(jié)果顯示,在Cd處理水平為1μmol/L時(shí),2個(gè)基因型煙草根系中Cd均以乙醇提取態(tài)含量最高,分別占到各化學(xué)形態(tài)總量的72.15%和71.36%,之后是氯化鈉提取態(tài)和去離子水提取態(tài),其他形態(tài)所占比例均非常低;2個(gè)基因型煙草葉片中Cd主要以氯化鈉提取態(tài)(分別占總量的54.22%和54.52%)和去離子水提取態(tài)(分別占總量的37.36%和37.89%)存在,其余形態(tài)含量較少。Cd處理水平升高到50μmol/L時(shí),K326和N.rustica根系中乙醇提取態(tài)Cd所占的比例明顯下降,去離子水提取態(tài)和醋酸提取態(tài)比例升高;葉片中Cd賦存形態(tài)的變化主要是去離子水提取態(tài)比例有所下降,氯化鈉提取態(tài)比例有所升高,Cd的賦存形態(tài)存在由活性較強(qiáng)的結(jié)合形態(tài)向活性較弱的結(jié)合形態(tài)轉(zhuǎn)化的趨勢(shì),這與于方明和吳菁等的研究結(jié)果類似,說(shuō)明蛋白質(zhì)、氨基酸等配體分子在煙草減輕Cd毒害中起重要作用。但是2個(gè)基因型煙草中Cd的化學(xué)形態(tài)沒(méi)有顯著的種間差異,說(shuō)明2個(gè)基因型煙草對(duì)Cd積累的差異與其化學(xué)賦存形態(tài)關(guān)系不大。3cd的沉積特征(1)K326和N.rustica顯示不同的Cd積累特征,且與濃度有關(guān)。低Cd濃度下,K326表現(xiàn)為根系和葉片積累,N.rustica以根系積累為主;高Cd濃度下均顯示根系積累特性。(2)K326和N.rustica中Cd主要結(jié)合于可溶組分中,K326中Cd的亞細(xì)胞分布還受Cd濃度的影響,高Cd濃度時(shí)K326細(xì)胞壁對(duì)Cd的截留能力顯著升高,可溶組分的截留能力下降。(3)2個(gè)基因型煙草中可溶組分結(jié)合Cd的比例高低與2個(gè)基因型煙草相應(yīng)部位所積累Cd的總量大小相一致,Cd在