鎘對(duì)不同鎘積累模式煙草根系分泌有機(jī)酸的影響

鎘對(duì)不同鎘積累模式煙草根系分泌有機(jī)酸的影響

鎘（cd）是已知的生物毒性因子之一，能在土壤中穩(wěn)定積聚，難以去除，并且容易被植物吸收和積累。進(jìn)入人體后，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，并積聚在一定程度上人體。煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,隨著社會(huì)對(duì)煙草的關(guān)注度越來(lái)越高,煙草的安全性問(wèn)題日益凸顯。煙葉中的鎘主要來(lái)源于土壤,最近研究發(fā)現(xiàn),與20世紀(jì)90年代相比,中國(guó)植煙土壤重金屬元素呈現(xiàn)出不同程度富集趨勢(shì),鎘的富集較為明顯,可能導(dǎo)致煙草中鎘積累的風(fēng)險(xiǎn)增加。作物對(duì)鎘的吸收存在基因型差異,利用這種差異已經(jīng)培育出了低鎘積累的小麥、向日葵、大豆等品種,對(duì)降低作物鎘含量起到了積極作用。有研究發(fā)現(xiàn),不同類(lèi)型的煙草對(duì)鎘的吸收也存在基因型差異,普通煙草表現(xiàn)為根系和葉片積累,黃花煙草則以根系積累為主,黃花煙草的耐鎘性強(qiáng)于普通煙草,然而目前尚不清楚造成鎘積累基因型差異的相關(guān)機(jī)制。植物根系分泌物尤其是低分子量有機(jī)酸可與土壤中的鎘螯合,形成“鎘-低分子有機(jī)酸”復(fù)合物,促進(jìn)土壤中鎘的釋放和植物對(duì)鎘的吸收,因此,根系分泌物高效溶解土壤鎘的能力可能與煙草鎘的富集有關(guān)。有研究表明,根系分泌有機(jī)酸組成差異是造成作物礦物積累差異的原因之一,但其在煙草耐鎘機(jī)制中的作用尚不清楚。為此,以根系鎘積累效率不同的兩個(gè)煙草基因型為材料,考察煙草根系分泌低分子量有機(jī)酸與煙草鎘吸收的關(guān)系,為揭示煙草吸收積累鎘的基因型差異提供依據(jù)。供試煙草品種為普通煙草品種K326和黃花煙草(N.rustica)。煙草種子經(jīng)過(guò)滅菌后于28℃黑暗條件下催芽,發(fā)芽后移入蛭石培養(yǎng)基中培養(yǎng)至6葉1心期備用。煙苗培養(yǎng)在恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行,控制條件為光照16h/d,溫度28℃(晝)/18℃(夜),相對(duì)濕度為70%。供試土壤為耕層紅壤,取自云南煙葉產(chǎn)區(qū)。土壤pH為5.31,有機(jī)質(zhì)、碳酸鈣、粘粒和全鎘含量分別為3.64g/kg,2.44mg/kg,27.61mg/kg和0.31mg/kg。1.2測(cè)試方法1.2.1土壤濕度及根際和非根際土壤的處理土壤盆栽試驗(yàn)于2013年5月在鄭州煙草研究院溫室進(jìn)行。Cd處理設(shè)置CK,1(處理1),5(處理2)和10(處理3)mg/kg4個(gè)水平,采用完全隨機(jī)組合,每處理重復(fù)4次。具體操作方法為:采集的耕層土壤樣品風(fēng)干磨碎過(guò)2mm篩后,Cd以Cd(NO3)2溶液形式按照上述濃度梯度拌入土壤中,保持土壤田間最大持水量,污染老化處理1個(gè)月。處理結(jié)束后,拌入NH4NO3,KNO3和KH2PO4作為基肥,N肥用量為0.1g/kg,N∶P∶K=1∶1.5∶3,裝入直徑18cm高12cm的塑料盆中,每盆裝土2kg,將大小一致的6葉1心期煙苗移入盆中,每盆定植1株,室溫條件下培養(yǎng)50d。參照Chen等的方法收集根際和非根際土壤。具體操作為:調(diào)節(jié)盆中土壤濕度使根系能夠順利移出,輕輕抖落根系上的大塊土,剩余附著在根系上的土用150mL蒸餾水沖下作為根際土壤的水溶液。取距離根系15cm以外的土壤5g作為非根際土壤,用150mL蒸餾水溶解作為非根際土壤的水溶液。植物樣品采集:根系除去表面土壤后用自來(lái)水沖洗干凈,吸水紙吸干表面水分后和地上部植株樣品一起在100℃下殺青10min,然后在65℃條件下烘干至恒質(zhì)量。1.2.2煙苗的培養(yǎng)和管理設(shè)置0.00(CK),0.25(處理1),1.00(處理2),10.00(處理3)和50.00(處理4)μmol/L5個(gè)Cd濃度處理,每處理重復(fù)3次,每重復(fù)兩株煙苗。具體操作為:選取大小一致的6葉1心期煙苗,用1/2Hoagland營(yíng)養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)1周后待用。煙苗培養(yǎng)所用容器為體積1.5L的塑料盆,每盆定植6株。培養(yǎng)條件與前期相同,培養(yǎng)期間每3d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。用Cd(NO3)2配置上述濃度梯度溶液,除Cd處理外,培養(yǎng)條件與前期相同,培養(yǎng)48h后煙苗用于收集根系分泌物。Cd處理后將煙苗從盆中取出,先用自來(lái)水沖洗3~5次,然后用蒸餾水沖洗3~5次,再用0.5mmol/LCaCl2溶液洗根30min,濾紙吸干表面水分后,將處理好的煙苗根放入含0.5mmol/LCaCl2的遮光容器中(200mL),收集根系分泌物,收集時(shí)間為4h,收集液用于根系分泌物低分子量有機(jī)酸的測(cè)定。1.3低分子量有機(jī)酸的測(cè)定土壤盆栽試驗(yàn)參照Szmigielask等的方法收集根系分泌物。具體操作:根際和非根際土壤樣品的土水混合物振蕩8h后,8000g離心15min,離心后的上清液作為根系分泌物的收集液。離心后的上清液和水培收集的根系分泌物樣品轉(zhuǎn)入真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,40℃下濃縮至近干,用10mL無(wú)菌重蒸餾水超聲波下溶解,置于-20℃冰箱保存,用于有機(jī)酸的測(cè)定。參照范洪黎等的方法測(cè)定根系分泌物低分子量有機(jī)酸并稍作修改,收集液經(jīng)0.45μm的濾膜過(guò)濾后,采用Agilent1200高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)測(cè)定。色譜條件:AgilentHC-C18(2),Analytical4.6×250mm5-Micon型反向色譜柱,流動(dòng)相為93%25mmol/LKH2PO4(pH2.4)和7%甲醇混合液,等梯度洗脫,洗脫時(shí)間為30min。流速為0.7mL/min,進(jìn)樣量為20μL,柱溫為(25±2)℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。測(cè)定11種有機(jī)酸,分別為草酸、酒石酸、甲酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、乳酸、乙酸、馬來(lái)酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸。采用外標(biāo)法進(jìn)行測(cè)定,峰面積法計(jì)算含量。1.4數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和做圖,SAS8.0軟件Duncan法進(jìn)行處理間差異顯著性分析。2結(jié)果與分析2.1cd對(duì)煙株生物量的影響由圖1可以看出,隨著Cd處理濃度的提高,Cd對(duì)煙株生物量的影響表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)生長(zhǎng),高濃度抑制生長(zhǎng)。紅壤中加入1mg/kgCd時(shí)煙株生物量高于對(duì)照,之后隨鎘處理濃度的提高煙株生物量逐漸下降。兩基因型煙草對(duì)鎘處理的響應(yīng)差異明顯。不同鎘濃度處理間K326生物量存在顯著差異,與對(duì)照相比,加入1mg/kgCd處理后煙株生物量顯著升高了20.92%,加入5mg/kg和10mg/kg的Cd處理后,生物量分別顯著下降了23.97%和51.14%。黃花煙草各處理間差異不顯著,表明黃花煙草有較強(qiáng)的耐鎘性,這與前人研究結(jié)果一致。2.2cd對(duì)黃花煙草根系低分子量?jī)傻置诹康挠绊懲寥琅柙栽囼?yàn)結(jié)果(圖2)顯示,3種鎘濃度處理下,兩基因型煙草根系分泌低分子量有機(jī)酸總量的變化趨勢(shì)與生物量的變化相似,表現(xiàn)為低濃度Cd處理促進(jìn)低分子量有機(jī)酸的分泌,高濃度抑制其分泌。K326在1mg/kgCd處理時(shí)低分子量有機(jī)酸總量顯著高于對(duì)照,升高了31.32%;5mg/kgCd處理時(shí)開(kāi)始降低,但與對(duì)照相比無(wú)顯著差異。N.rustica在1和5mg/kgCd處理時(shí)低分子量有機(jī)酸的分泌量均高于對(duì)照,5mg/kgCd處理顯著升高了35.96%,且其低分子量有機(jī)酸總量顯著高于K326。10mg/kgCd處理時(shí)開(kāi)始降低,與對(duì)照相比顯著下降了41.71%。水培試驗(yàn)結(jié)果(圖3)顯示,黃花煙草根系低分子量有機(jī)酸的分泌仍表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的趨勢(shì)。與對(duì)照相比,0.25μmol/LCd處理后,低分子量有機(jī)酸總量顯著升高了23.22%,之后隨著Cd濃度的提高有機(jī)酸總量逐漸下降;K326則呈現(xiàn)出隨鎘濃度升高逐漸下降的趨勢(shì),0.25,1.00,10.00和50.00μmol/LCd濃度處理后,根系分泌物總量均顯著低于對(duì)照,分別為對(duì)照的86.02%,80.68%,78.19%和68.95%。所有處理中,N.rustica的有機(jī)酸總量均顯著高于K326,這與土壤盆栽試驗(yàn)結(jié)果一致。有研究表明,植物產(chǎn)生有機(jī)酸可以緩解重金屬毒性,低分子量有機(jī)酸總量越高,對(duì)鎘的抗性越強(qiáng)。本研究中,無(wú)論是土培還是水培條件下的Cd處理,黃花煙草根系分泌低分子量有機(jī)酸總量都明顯高于普通煙草品種K326。這說(shuō)明根系分泌較多的低分子量有機(jī)酸可能是黃花煙草具有較高耐鎘性的原因之一。2.3不同處理對(duì)煙草根系產(chǎn)物的活性影響由表1可以看出,土壤盆栽試驗(yàn)中,主要檢出的低分子量有機(jī)酸為草酸、甲酸、乳酸、酒石酸和馬來(lái)酸。其中,草酸含量最高,占低分子量有機(jī)酸總量的72.34%~93.66%,是煙草根系分泌的主要有機(jī)酸。其次是甲酸、乳酸、酒石酸,分別占總量的1.40%~15.46%,1.04%~6.84%和1.02%~4.47%。此外,還檢出較低含量的馬來(lái)酸。不同基因型間也有所差異。K326各處理中還檢出蘋(píng)果酸和含量較低的檸檬酸和富馬酸,部分處理中檢出了乙酸和丙二酸;N.rustica部分處理中檢出了乙酸和丙二酸。除10mg/kg鎘處理外,其他處理中N.rustica根系分泌的草酸含量均高于K326;所有處理中N.rustica根系分泌的酒石酸、甲酸和乳酸含量均高于K326。由圖4可以看出,兩煙草基因型間草酸、酒石酸、甲酸和乳酸占低分子量有機(jī)酸總量的比例差異不顯著。與土培試驗(yàn)相比,水培條件下較容易保證各重復(fù)間pH值、營(yíng)養(yǎng)及Cd處理濃度的一致性,更有利于提取和鑒定根系分泌物。水培試驗(yàn)中(表1)檢出的主要低分子量有機(jī)酸含量從高到低依次為草酸、甲酸、乳酸、酒石酸。草酸占煙草根系分泌低分子量有機(jī)酸的78.38%~89.43%,是根系分泌的主要低分子量有機(jī)酸。甲酸、乳酸和酒石酸分別占總量的8.18%~17.69%,1.11%~2.64%和1.11%~1.59%,在各處理中還檢出了含量較低的馬來(lái)酸和富馬酸,部分處理中檢出了蘋(píng)果酸。與土壤盆栽試驗(yàn)相比,水培試驗(yàn)沒(méi)有檢出乙酸、丙二酸和檸檬酸,說(shuō)明根系分泌物原位收集法和溶液培養(yǎng)收集法所獲得的有機(jī)酸種類(lèi)和數(shù)量并不完全相同,這與田中民等的研究結(jié)果相似。除個(gè)別處理外,N.rustica根系分泌的草酸、酒石酸、甲酸和乳酸含量均高于K326。由圖5可以看出,兩煙草基因型間草酸、酒石酸、甲酸和乳酸占低分子量有機(jī)酸總量的比例差異不顯著,這與土壤盆栽試驗(yàn)結(jié)果相似。綜上所述,兩基因型煙草對(duì)鎘的響應(yīng)機(jī)制差異可能與低分子量有機(jī)酸的組成比例無(wú)特異性關(guān)系,而與各低分子量有機(jī)酸的分泌量有關(guān)。3不同處理對(duì)黃花煙草根系物合成的影響(1)低濃度鎘處理可促進(jìn)煙苗生長(zhǎng),高濃度鎘處理則抑制煙苗生長(zhǎng),土壤盆栽條件下10mg/kg鎘處理對(duì)煙草有明顯的毒害作用。與K326相比,N.rustica表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐鎘性。(2)在土壤