黃瓜花葉病毒亞組的傳毒效率比較研究

黃瓜花葉病毒亞組的傳毒效率比較研究

黃瓜花葉病毒（cmv）主要通過非連續(xù)性傳播，如cucumbermasaic病毒（cmv）。最常見的是棉蚜(Aphisgossypii)和綠色桃蚜(Myzuspersicae)。CMV傳播?；暂^低,目前認(rèn)為CMV可以由80多種蚜蟲傳播。蚜蟲刺吸病毒侵染的植物不到一分鐘即可獲毒,然后可迅速地傳播到感病植物上。CMV傳播效率受蚜蟲種類、毒源植物種類等多種因子影響。不同種類寄主上常見不同蚜蟲種群。蚜蟲的成功傳毒依賴于獲毒、持毒、病毒穩(wěn)定性、病毒釋放等幾個(gè)環(huán)節(jié),蚜蟲獲毒前饑餓可以增加傳毒效率,任意環(huán)節(jié)的變化均可能影響蚜傳效率。目前,造成我國CMV頻發(fā)的原因除與氣候變暖、種植結(jié)構(gòu)和種植制度改變有關(guān)之外,更直接的原因可能是因此而引發(fā)的傳毒介體的發(fā)育速度和繁殖率的加快,因?yàn)閭鞫窘轶w連年不間斷地大發(fā)生,可以直接導(dǎo)致CMV的危害猖獗。近年來,黃瓜花葉病毒亞組II株系在我國危害的報(bào)道不斷增加,具有與亞組I病毒混合爆發(fā)的趨勢。本研究通過北京地區(qū)主要發(fā)生的幾種傳毒蚜蟲,對(duì)CMV亞組Ⅰ、Ⅱ的兩個(gè)分離物進(jìn)行了室內(nèi)及田間模擬傳毒試驗(yàn),通過傳毒效率比較,期望獲取一些關(guān)于CMV兩亞組病毒傳播和流行趨勢方面的信息,為預(yù)測CMV兩亞組病毒在我國進(jìn)一步的流行并制定相應(yīng)的預(yù)防控制措施提供科學(xué)依據(jù)。1材料和方法1.1elisa緩沖液的制備CMV抗血清:包括能夠捕捉所有CMV分離物的包被抗體以及具有亞組Ⅰ、Ⅱ特異性的檢測抗體和酶標(biāo)抗體。ELISA緩沖液:包被緩沖液、洗滌緩沖液、抗體稀釋緩沖液、樣品抽提緩沖液、酶底物緩沖液。以上血清及緩沖液均由美國Agdia公司訂購的ELISA試劑盒提供。1.2病毒毒傳播方式繁殖毒原植物:CMV系統(tǒng)侵染寄主三生煙(N.tabacumcv.SamsunNN)。供試病毒寄主植物:CMV系統(tǒng)侵染寄主三生煙健康幼苗,在4～5葉期接種病毒。病毒毒原:CMV亞組Ⅰ強(qiáng)致病病毒株系YQ,采自北京延慶的番茄;亞組Ⅱ溫和病毒株系ZL,采自浙江麗水的番茄。病毒樣品以摩擦接種的方法接種在4～5葉期的三生煙幼苗上,接種后的幼苗置防蟲籠內(nèi)培養(yǎng),在溫室內(nèi)繁殖備用。1.3南果梨aphisivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivivi采集北京地區(qū)十字花科、茄科、葫蘆科及豆科植物材料上常見的幾種蚜蟲,用于脫毒飼養(yǎng)。其中,桃蚜(Myzuspersicae)、蘿卜蚜(Lipaphiserysimi)采于北京種植的甘藍(lán)(Brassicaoleracea);棉蚜(Aphisgossypii)采于北京種植的西瓜(Citrulluslanatus);豆蚜(AphiscraccivoraKoch)采于北京種植的菜豆(Phaseolusvulgaris);修尾蚜(MegourajaponicaMatsumura)采自北京陽臺(tái)山的山黧豆(Lathyrussp)。1.4發(fā)揮病蟲草害的繁殖將從田間捕捉到的桃蚜、棉蚜、蘿卜蚜、豆蚜和修尾蚜5種蚜蟲饑餓3h進(jìn)行初脫毒,然后飼養(yǎng)在防蟲網(wǎng)室的無毒苗上。其中桃蚜、蘿卜蚜飼養(yǎng)在雪里蕻(Brassicajuncea)上,棉蚜飼養(yǎng)在黃瓜(Cucumissativus)苗上,豆蚜和修尾蚜飼養(yǎng)在蠶豆(Viciafaba.)苗上。取在植株上剛出生且未取食的若蚜,再轉(zhuǎn)移到新的無毒植株上飼養(yǎng)。防蟲網(wǎng)室內(nèi)單克隆繁殖3代,經(jīng)ELISA檢測證實(shí)無毒以后,大量繁殖獲得無毒蚜,供試驗(yàn)所需。一般1周后可得到大量的若蚜,待發(fā)育至4齡無翅若蚜?xí)r方可供傳毒試驗(yàn)使用。1.5蚜蟲對(duì)cmv不同亞組的室內(nèi)傳毒率的試驗(yàn)1.5.1監(jiān)控樹出洞,開洞為保證接種效果,接種前必須使蚜蟲饑餓一定時(shí)間,方法如下:取培養(yǎng)皿數(shù)個(gè),將口用玻璃紙封好,并用橡皮筋縛緊,在玻璃紙中間開一小洞,用柔軟毛筆取蚜蟲從小洞放入培養(yǎng)皿(取蚜蟲時(shí)可將帶蚜蟲的葉片,輕輕敲打或稍加熱烘一下,使蚜蟲自己掉下,以免蚜蟲的口器受傷),每皿放入蚜蟲50個(gè)左右,然后用玻璃紙將小洞重新封閉,將培養(yǎng)皿放在25～30℃的溫暖處。為讓蚜蟲下一步在煙草上充分取食,蚜蟲饑餓3h。1.5.2實(shí)行飼毒制度將經(jīng)過饑餓的蚜蟲重新用毛筆從玻璃小洞中取出,挑到毒原植株發(fā)病癥狀明顯的嫩葉上飼喂,飼毒時(shí)間為15min(一般5min即可充分獲毒),以保證每頭蚜蟲帶毒的一致性。獲毒飼育時(shí)間為蚜蟲口針刺入吸食的時(shí)間。1.5.3及時(shí)接種與接種蚜蟲飼毒達(dá)到所要求的時(shí)間后,用毛筆將其移置無病的煙草幼苗上。為避免轉(zhuǎn)移時(shí)損傷蚜蟲口針,轉(zhuǎn)移前先將帶蚜蟲的葉片移近熱源微熱使蚜蟲自動(dòng)拔出口針,再用小毛筆將其輕輕挑下,置于100mL玻璃杯中備用。每株幼苗接種蚜蟲12頭,每個(gè)病毒分離物接種15株三生煙苗。供試的病毒分離物有YQ(I)、ZL(II),接種后的幼苗放在防蟲籠內(nèi)培養(yǎng),接種24h后,先用毛筆挑走蚜蟲,再噴20%菊殺乳油(稀釋2000倍)進(jìn)一步滅蚜。對(duì)照接種是將饑餓后的蚜蟲放在無病毒的健康煙草植株上吸食15min,然后用毛筆移到另一株無病煙草幼苗上,其他操作步驟與傳毒相同。每個(gè)傳毒試驗(yàn)重復(fù)2次。將傳毒的煙苗置25℃左右的防蟲溫室中繼續(xù)生長15d,以繁殖的毒原為陽性對(duì)照,健康煙苗為陰性對(duì)照,ELISA檢測傳毒煙苗的帶毒情況,計(jì)算蚜蟲傳毒效率,并以卡平方方法統(tǒng)計(jì)傳毒效率的差異顯著性。1.6cmv兩組分離物蚜蟲田間模擬傳播試驗(yàn)1.6.1防蟲網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行規(guī)制為防止人為的CMV兩亞組分離物的傳播和蔓延,試驗(yàn)地點(diǎn)選擇在遠(yuǎn)離其他菜地、相對(duì)獨(dú)立的兩個(gè)防蟲網(wǎng)室內(nèi)進(jìn)行。在溫室內(nèi)培育的健康三生煙苗出4～5片葉時(shí)移栽于露地的網(wǎng)室,每個(gè)網(wǎng)室移栽三生煙苗150株,移栽后進(jìn)行常規(guī)的澆水管理,出入網(wǎng)室要防止環(huán)境中帶毒蚜蟲飛入。1.6.2煙苗接種方案定植于網(wǎng)室的煙苗緩苗10d后,隨機(jī)選擇5點(diǎn),每點(diǎn)選擇相鄰煙苗2株,分別摩擦接種兩亞組病毒YQ(Ⅰ)和ZL(Ⅱ),5點(diǎn)共計(jì)接種10株煙苗,作為蚜蟲傳播的毒原植物,并標(biāo)記被接種植物。1.6.3加強(qiáng)病毒病培養(yǎng)和管理5d后,接種的毒原植物已產(chǎn)生輕微癥狀,在每株毒原植物上,投放經(jīng)饑餓處理3h的桃蚜、棉蚜、蘿卜蚜、豆蚜、修尾蚜5種無毒蚜蟲各20頭,定時(shí)觀察每種蚜蟲的取食、遷移情況及病毒病發(fā)病情況。地塊管理以保持干旱為主,以促進(jìn)蚜蟲的繁殖、擴(kuò)散及病毒傳播。投放傳毒蚜蟲后,每日觀察蚜蟲的增殖數(shù)量及擴(kuò)散情況。20d后,隨機(jī)采樣30株(不包括接種植株),以ELISA方法測定每個(gè)樣品中的亞組Ⅰ、Ⅱ病毒分離物,計(jì)算蚜蟲傳毒效率(發(fā)病株數(shù)/檢測株數(shù)),并以卡平方法統(tǒng)計(jì)差異顯著性。2結(jié)果與分析2.1對(duì)病毒分離效果的影響分別采用桃蚜、棉蚜、蘿卜蚜、豆蚜及修尾蚜對(duì)YQ(I)、ZL(II)2個(gè)分離物進(jìn)行了室內(nèi)傳毒效率測定,通過對(duì)傳毒幼苗的癥狀觀察及ELISA檢測,各種蚜蟲傳毒效率及統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。由表1統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明,桃蚜對(duì)亞組Ⅰ病毒YQ的傳毒效率高于對(duì)亞組Ⅱ病毒ZL的傳毒效率,兩者在P<0.05水平上差異顯著。相反,棉蚜對(duì)亞組Ⅱ病毒ZL的傳毒效率高于對(duì)亞組Ⅰ病毒YQ的傳毒效率,兩者在P<0.01水平上差異顯著。桃蚜和棉蚜都是食性和分布較廣泛傳毒蚜蟲,它們對(duì)CMV不同亞組分離物的傳播效率的差異將會(huì)直接影響病毒的傳播和流行。蘿卜蚜、豆蚜、修尾蚜對(duì)亞組Ⅰ病毒YQ及亞組Ⅱ病毒ZL的傳毒效率均沒有顯著性差異。蘿卜蚜在茄科和十字花科蔬菜上發(fā)生普遍,它對(duì)CMV不同亞組分離物的傳播效率也對(duì)病毒的傳播和流行起著重要的作用。豆蚜主要危害豆科植物,也取食茄科植物。修尾蚜主要取食豆科植物、也可以在煙草等茄科植物上暫時(shí)取食。豆蚜、修尾蚜對(duì)CMV不同亞組分離物的傳播效率對(duì)2亞組病毒的流行也有一定的影響。2.3傳播效率試驗(yàn)結(jié)果由表2的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可見,兩個(gè)重復(fù)試驗(yàn)中,亞組Ⅱ病毒ZL分離物的檢出率分別為83%和87%,顯著高于亞組Ⅰ病毒YQ的檢出率60%和63%,高出20%以上。這一結(jié)果與前面的室內(nèi)傳毒效率試驗(yàn)結(jié)果有很強(qiáng)的相關(guān)性。室內(nèi)傳播效率試驗(yàn)中,棉蚜對(duì)亞組Ⅱ病毒ZL的傳播效率在P<0.01水平上顯著高于對(duì)亞組Ⅰ病毒YQ的傳播,而且在露地試驗(yàn)當(dāng)中,因?yàn)闊煵莶皇敲扪恋淖钸m宜寄主,它的頻繁試探取食和快速擴(kuò)散,也大大地促進(jìn)了亞組Ⅱ病毒ZL的傳播。這一結(jié)果證明了在本試驗(yàn)條件下,CMV亞組Ⅱ溫和株系ZL的綜合傳播擴(kuò)散能力高于亞組Ⅰ強(qiáng)致病株系YQ。3自然條件與病毒傳播的關(guān)系CMV是植物病毒中最具經(jīng)濟(jì)重要性的病毒之一,CMV可以由桃蚜、蘿卜蚜、甘藍(lán)蚜、棉蚜、豆蚜、茄無網(wǎng)蚜、豌豆蚜等80多種蚜蟲非持久性傳播。既然非持久性蚜傳病毒的介體種類和傳毒效率是有?；缘?那么對(duì)CMV兩亞組病毒分離物室內(nèi)傳毒效率的比較研究可以在一定程度上反應(yīng)病毒在傳播和流行上的差異。本研究所采用的5種傳毒蚜蟲中,桃蚜對(duì)亞組Ⅰ病毒YQ的傳毒效率顯著高于對(duì)亞組Ⅱ病毒ZL的傳毒效率,這一結(jié)果似乎與目前我國流行的CMV主要以亞組Ⅰ為主相吻合。但棉蚜對(duì)亞組Ⅰ、Ⅱ兩個(gè)分離物的傳毒效率恰好相反,棉蚜對(duì)亞組Ⅱ病毒ZL的傳毒效率顯著高于對(duì)亞組Ⅰ病毒YQ的傳播。所以,如果在某一地區(qū)或某一寄主上的蚜蟲以棉蚜為主時(shí),亞組Ⅱ病毒ZL在傳播和流行上便有可能會(huì)占優(yōu)勢。由此看來,單從蚜傳效率高低的角度出發(fā),并不能解釋我國CMV的流行以亞組Ⅰ病毒為主的現(xiàn)象,即,亞組Ⅱ病毒同樣具有大范圍流行的蚜傳條件。在自然條件下,由于病毒的復(fù)合侵染、蚜蟲的取食行為以及傳毒過程中病毒-蚜蟲-寄主之間的互作,使得病毒侵染、傳播和流行的過程和最終結(jié)果更為復(fù)雜。所以,在自然條件下,病毒的田間傳播試驗(yàn)才能更真實(shí)地反映蚜蟲介體對(duì)病毒病流行的影響。本研究在露地傳播試驗(yàn)中,投放了同等數(shù)量5種傳毒蚜蟲,病毒的田間傳播結(jié)果,包含了以上幾種蚜蟲對(duì)病毒的傳毒效率及其在煙草寄主上自由取食、自由擴(kuò)散等行為特性的綜合影響。研究結(jié)果表明,亞組Ⅱ病毒(ZL)在田間的傳播率高于亞組Ⅰ病毒(YQ)。這一結(jié)果與室內(nèi)傳毒效率的研究結(jié)果共同佐證了亞組Ⅱ病毒也具備了與亞組Ⅰ病毒同樣的介體傳播的流行條件,也在一定程度上解釋了近年來亞組Ⅱ病毒株系在我國報(bào)道頻率的增加。這對(duì)綜合分析CMV兩亞組病毒未來在我國的流行趨勢有重要參考價(jià)值。但本研究中使用的方法也存在許多限制,由于開放型的田間傳播試驗(yàn)無法完全控制周邊遷飛蚜蟲的帶毒情況,而更多的不同種類的蚜蟲脫毒飼養(yǎng)也存在難度,所以在田間試驗(yàn)中僅投放了固定數(shù)量的少數(shù)幾種蚜蟲。這一試驗(yàn)僅是對(duì)田間蚜蟲傳播試驗(yàn)的一種模擬,而不能完全反映自然條件下復(fù)雜的蚜傳情況。劉愛芝等曾在煙草栽培區(qū),利用黃皿和綠皿共誘集傳毒介體有翅蚜32種,其中桃蚜和棉蚜分別占誘集蚜蟲總量的70%,在煙草發(fā)育的不同階段,誘集到的蚜蟲種類及組成比例也不同。而且,過去的研究認(rèn)為,遷飛來的非寄生性“過路”蚜蟲在非持久性蚜傳病毒病的流行中起著重要作用。所以,可以想象,在不同的氣候條件及不同的作物栽培結(jié)構(gòu)條件下,有不同的蚜蟲種群結(jié)構(gòu),而特定的介體種群結(jié)構(gòu)將會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)谻MV不同株系類群的傳播產(chǎn)生不同的影響。所以,病毒病在田間的實(shí)際傳播和流行,同時(shí)受到氣候、傳毒蚜蟲的種類、數(shù)量、蚜蟲傳毒效率、病毒-蚜蟲-寄主之間的互作等諸多因素的影響?？傊?蚜蟲與病毒病的流行關(guān)系密切。蔬菜上能夠傳播CMV的蚜蟲種類多、繁殖快、適應(yīng)性強(qiáng),從露地到溫室都有危害。不同蚜蟲傳毒效率不同,同種蚜蟲在不同溫度或寄主條件下傳毒效率也有很大差異。所以,用有限的幾種蚜蟲