一株抗黃瓜立枯病菌哈茨木霉的分離鑒定及特性研究

一株抗黃瓜立枯病菌哈茨木霉的分離鑒定及特性研究

黃瓜是由番茄屬的rhi澤消毒引起的一種重要的土壤傳播疾病?；颊呱L緩慢，嚴重時死亡。目前尚缺乏有效的抗病品種,主要是通過農(nóng)藝措施和化學藥劑拌種進行防治,但效果欠佳。篩選和利用微生物代謝產(chǎn)物中的活性物質(zhì)來控制有害生物,是目前新農(nóng)藥研制中的一個重要途徑。植物內(nèi)生真菌是一種新型的微生物資源,是指在植物寄主中度過全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類真菌,其在長期的進化過程中與寄主植物建立了互惠共生的關(guān)系。許多植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物都具有多種生物活性。枸骨IlexcornutaLindl.et.Paxt.為冬青科冬青屬植物,屬常綠灌木或喬木,主要分布于我國長江中下游地區(qū),其根、枝、葉和果均可入藥,其葉更是常用中藥。本研究組已從枸骨中分離得到幾百株植物內(nèi)生菌株,通過系統(tǒng)篩選確定其中編號為No.2的內(nèi)生真菌抑菌作用最強。對該真菌發(fā)酵液的活性物質(zhì)進行分離、提純和結(jié)構(gòu)鑒定,表明其主要活性成分為倍半萜類化合物——木霉素(trichodermin)。本文報道借助Biolog微生物自動分析儀對該活性菌株進行分類鑒定的結(jié)果,以及其活性成分木霉素對黃瓜立枯病的生防效果。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1植株分離和分離內(nèi)生真菌No.2菌株為在實驗室中從枸骨植株中分離得到;病原菌立枯絲核菌Rhizoctoniasolani由中國計量學院生物安全與食品科學研究所保存并提供。1.1.2菌株、葡萄糖、脂糖馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂15g;馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PD):馬鈴薯200g,葡萄糖20g;麥芽汁培養(yǎng)基:麥芽浸膏130g,瓊脂15g,氯霉素0.1g。1.1.3多福美雙-多福thiram農(nóng)藥木霉素(trichodermin)由本實驗室制備并鑒定,對照藥劑為40%多菌靈·福美雙(carbendazin+thiram,簡稱多·福)可濕性粉劑由濰坊瑞星農(nóng)藥有限公司生產(chǎn),以清水為空白對照。1.2菌餅接種培養(yǎng)參照Biolog公司提供的微生物自動分析儀——絲狀真菌鑒定操作規(guī)程,將新鮮的內(nèi)生真菌No.2菌餅接種至2%的麥芽汁平板上,28℃下培養(yǎng)6d。用無菌水洗下孢子,將孢子懸液滴入到Biolog培養(yǎng)液中,并調(diào)整至相應的濁度,用排槍將孢子懸液接種于96孔培養(yǎng)鑒定板中,28℃下培養(yǎng)72h,用Biolog讀數(shù)儀(美國Biolog公司生產(chǎn),型號Microlog)讀取結(jié)果。1.3生長情況的測定采用對峙培養(yǎng)法,用無菌打孔器分別在新鮮的No.2菌株和立枯絲核菌菌落邊緣打取直徑為5mm的菌餅,在準備好的PDA平板上取距離約為2cm的兩點(直徑兩端),一邊接種No.2菌餅,另一端接種立枯絲核菌菌餅,重復3次,28℃下培養(yǎng),定時觀測兩菌餅向四周輻射生長情況。1.4蓋玻片生長裝置在1.3節(jié)試驗的基礎上,平行斜插一蓋玻片于兩菌餅的邊緣,以便使兩種菌絲向蓋玻片上交叉生長。培養(yǎng)24h后取下蓋玻片,顯微鏡觀察重寄生現(xiàn)象。1.5木霉菌的分離采用搖瓶發(fā)酵法。在300mL三角瓶中加入60mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌,待冷卻后于每只培養(yǎng)瓶中接種1mLNo.2菌株孢子懸浮液,置于恒溫搖床上于28℃下培養(yǎng)3d,搖床轉(zhuǎn)速為180r/min。發(fā)酵液在5000r/min下離心10min,取上清液,經(jīng)乙酸乙酯萃取,硅膠柱和ODS反相層析柱分離得純的木霉素(純度為99.6%),其含量(150mg/L)通過氣相色譜法檢測。木霉素的分子式為C17H24O4,結(jié)構(gòu)式如(Ⅰ)所示。1.6測定黃瓜病害采用盆栽試驗法測定木霉素對黃瓜立枯病的生防效果。采用高11cm和上口徑為14cm的塑料盆缽進行黃瓜苗室內(nèi)盆栽,當瓜苗長至四葉期時,選取長勢一致的植株進行試驗。黃瓜立枯絲核菌采用灌根法接種。木霉素活性試驗包括木霉素質(zhì)量濃度分別為150,125和100mg/L3個處理,每處理重復3次,同時以40%多·?？蓾裥苑蹌┫♂?000倍液為藥劑對照,并設清水為空白對照。保護作用測定:采用先噴藥后接病菌的方法。先在盆栽黃瓜苗的根莖部位灌施不同濃度木霉素藥液,24h后接種黃瓜立枯絲核菌。每處理重復3次,每重復10盆瓜苗。7d后記錄秧苗發(fā)病情況。治療作用測定:采用先接病菌后施藥的方法。在保濕條件下接種立枯絲核菌,于發(fā)病初期進行第1次施藥,以后每隔7d施藥1次,共施3次。每處理3次重復,每重復10盆瓜苗。于噴藥前調(diào)查秧苗病情,以后于每次噴藥后7d調(diào)查1次,記錄病株數(shù),由(1)、(2)式分別計算病情指數(shù)和防治效果。每次噴藥后觀察黃瓜生長及葉片發(fā)病情況。黃瓜苗根莖部發(fā)病嚴重度分級標準為:0級,健康苗;1級,莖基或根部稍現(xiàn)病斑或稍變色;2級,1/3或1/2莖基或根部出現(xiàn)病斑或變色腐爛;3級,全莖或根部被病斑環(huán)繞、變色、腐爛;4級,黃瓜苗萎蔫枯死。2結(jié)果與分析2.1哈茨木霉菌trap互聯(lián)網(wǎng)檢測借助Biolog微生物自動分析系統(tǒng),利用微生物對不同碳源代謝率的差異,通過與標準菌株數(shù)據(jù)庫(系統(tǒng)自帶)進行比對,發(fā)現(xiàn)其菌落和菌絲形態(tài)特征與數(shù)據(jù)庫中提供的哈茨木霉菌株圖片形態(tài)特征相似,相似性為0.653,初步鑒定該No.2菌株應為哈茨木霉菌TrichodermaharzianumRifai。No.2的菌落、菌絲和孢子形態(tài)見圖1。2.2哈茨木霉菌的生長速率實驗結(jié)果(表1,圖2)表明,內(nèi)生真菌哈茨木霉菌和黃瓜立枯絲核菌在同一培養(yǎng)皿上生長存在營養(yǎng)競爭和空間競爭,哈茨木霉菌生長速率較快,能夠迅速地占領空間吸收營養(yǎng)。當立枯絲核菌的菌絲遇到哈茨木霉菌菌絲后,生長速率減慢,逐漸被哈茨木霉菌菌絲及分生孢子叢覆蓋。培養(yǎng)5d后,哈茨木霉菌占據(jù)了整個平皿,立枯絲核菌逐漸被哈茨木霉菌消解,最終死亡。2.3菌株寄生蟲能力的比較從圖3可以看出哈茨木霉菌菌絲沿著或纏繞立枯絲核菌菌絲生長,兩菌株間存在寄生現(xiàn)象,這一結(jié)果與Almeida等報道的哈茨木霉菌的寄生能力相似,說明從植物中分離到的內(nèi)生哈茨木霉菌與自土壤中分離的該菌株同樣具有寄生病原真菌的能力。2.4木氧化酶木激素防治效果盆栽試驗結(jié)果(見表2)表明,木霉素對黃瓜立枯病均有不同程度的治療和保護作用,防效均在60%以上。保護作用中,125和100mg/L的木霉素與對照藥劑的防治效果差異極顯著,而150mg/L木霉素的防治效果與對照藥劑無明顯差異,7d后木霉素的防效達88.89%。治療作用中,施藥后7d防效達最高,150mg/L的木霉素的防效為95.83%,與對照藥劑相當;施藥后14d,3個處理的防效均低于對照藥劑,150與125mg/L的木霉素的治療效果無明顯差異;施藥后21d,3個處理的防效與施藥后14d的相當或略差,仍低于對照藥劑?？梢?木霉素對黃瓜立枯病具有一定的速效性,但總體上持效性不如對照藥劑。此外,據(jù)施藥后目測觀察,各處理對黃瓜的株形、葉色均未產(chǎn)生藥害癥狀,安全性較好。3內(nèi)生真菌的分離純化及鑒定哈茨木霉菌是一種廣泛應用于植物真菌病害防治的生防菌,相關(guān)研究報道較多,但有關(guān)哈茨木霉菌作為植物內(nèi)生真菌的報道卻很少。Evans等雖然從可可樹中分離到100余株內(nèi)生木霉菌,但只進行了少數(shù)幾株木霉菌的生防能力的研究。已有研究表明,內(nèi)生木霉菌菌株間產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)和寄生病原菌的能力存在差異,但有關(guān)內(nèi)生木霉菌產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物為何種物質(zhì)未見相關(guān)報道。本研究組首次從浙江天目山采集的枸骨植物中分離到一株活性內(nèi)生真菌No.2,并通過分離純化明確了其活性代謝產(chǎn)物的主要成分為一倍半萜類化合物木霉素,同時建立了該化合物的氣相色譜檢測方法。在前期研究的基礎上,筆者通過形態(tài)和生理生化特征相結(jié)合的方法初步鑒定該內(nèi)生真菌為哈茨木霉菌株,同時系統(tǒng)研究了內(nèi)生哈茨木霉菌對黃瓜立枯絲核菌的競爭和寄生作用,其代謝產(chǎn)物木霉素對黃瓜立枯病的生防效果。盆栽試驗表