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文檔簡介

實驗十植物總RNA的提取RNA的制備與分析對于了解基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)與調(diào)控和cDNA的合成都是必須的，RNA的純度和完整性對于Northernblot，RT-PCR和cDNA文庫的構(gòu)建等分子生物學(xué)實驗都至關(guān)重要。RNA分離的方法很多，其中最關(guān)鍵的因素是盡量減少RNA酶的污染異硫氰酸胍法、SDS-酚法、CTAB法及試劑盒提取法人的汗液，呼吸氣體，唾液等都含有大量的RNase；植物組織細(xì)胞本身內(nèi)部也含有大量RNaseRNase變性劑常用的有DEPC、氧釩核糖核苷復(fù)合物等RNase抑制劑有：RNaseinhibitor、亞精胺、尿素、巰基乙醇等基本知識一、實驗?zāi)康模毫私庹婧松锘蚪MRNA提取的一般原理。通過RNA電泳帶評價RNA質(zhì)量。二、一般原理CTAB裂解植物細(xì)胞LiCl沉淀總RNA亞精胺和β-巰基乙醇等抑制RNA酶。酚/氯仿/異戊醇除去蛋白質(zhì)

三、材料

植物組織：植物葉片四、設(shè)備

移液器，冷凍高速離心機(jī)，低溫冰箱，臺式高速離心機(jī)，液氮罐，陶瓷研缽，1.5ml離心管。提取液成分:20g/LCTAB,20g/LPVP,50mmol/LEDTA，4.0mol/LNaCl，100mmol/LTris-HCl-----每組200ml（用0.1%的DEPC水配制），分裝3~4瓶滅菌。10mol/LLiCl（用0.1%的DEPC水配制），分裝3~4瓶滅菌無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃2小時）裝蒸餾水，然后加入0.1%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌20ml*575%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制，每組200ml

，分裝3~4瓶），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。氯仿:異戊醇(24:1byvolume)或氯仿.200ml，分裝3~4瓶異丙醇、無水乙醇、70％乙醇巰基乙醇、亞精胺（100mol/L）10ml五、試劑

六、操作步驟材料處理：將材料從-70℃冰箱中取出放入到已滅菌并用液氮預(yù)冷的研缽中，葉片，根，莖，果分別取1-2g，快速將材料研磨成粉末狀，然后轉(zhuǎn)入帶1.5mL離心管中2.加入65℃預(yù)熱1小時的RNA提取液0.7mL、3μL的亞精氨和8μL的β-巰基乙醇混勻，65℃水浴4-5min3.加0.7mL的氯仿-異戊醇（24∶1，v/v），混勻4-5分鐘，12000

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