熒光定量PCR實驗指南一

熒光定量PCR實驗指南（一）一、基本環(huán)節(jié)：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；2、引物、探針的設(shè)計；3、引物探針的合成；4、反映體系的配制；5、反映條件的設(shè)定；6、反映體系和條件的優(yōu)化；7、熒光曲線和數(shù)據(jù)分析；8、原則品的制備；二、技術(shù)核心：1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比對；從。下載的方式有兩種：一為打開某個序列后，直接點(diǎn)擊“save”，保存格式為“.txt”文獻(xiàn)。保存的名稱中要涉及序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后，再打開DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“import”，打開后點(diǎn)擊“save”，保存為“.seq”文獻(xiàn)。另一種直接用DNAstar軟件中的Editseq軟件，點(diǎn)擊“file”菜單中的“openentrezsequence”，導(dǎo)入后保存為“.seq”文獻(xiàn)，保存的名稱中要涉及序列的物種、序列的亞型、序列的注冊號。然后要對全部的序列進(jìn)行排序。用DNAstar軟件中的Seqman軟件，點(diǎn)擊“sequence”菜單中的“add”，選擇要比較的“.seq”的全部文獻(xiàn)，點(diǎn)擊“add”或“addall”，然后點(diǎn)擊“Done”導(dǎo)入要比較的序列，再點(diǎn)擊“assemble”進(jìn)行比較。橫線的上列為一致性序列，全部紅色的堿基是不同的序列，一致的序列用黑色堿基表達(dá)。有時要設(shè)定比較序列的開始與結(jié)尾。有時由于參數(shù)設(shè)立的因素，可能分為幾組(contig)，若想全部放在一組中進(jìn)行比較，就調(diào)節(jié)“project”菜單下的“parameter”，在“assembling”內(nèi)的“minimummathpercentage”默認(rèn)設(shè)立為80，可調(diào)低即可。再選擇幾個組，點(diǎn)擊“contig”菜單下的“reassemblecontig”即可。選擇高低的原則是在確保所分析的序列在一種“contig”內(nèi)的前提下，盡量提高“minimummathpercentage”的值。有時因此個別序列因素，會出現(xiàn)重復(fù)序列，堿基的缺失或插入，要對“contig”的序列的排列進(jìn)行修改，確保排列是每個序列的真實且排列同源性最佳的排列。然后，點(diǎn)擊“save”保存即可。分析時，重要是觀察與否全部為一致性的黑色或紅色，對于彌散性的紅色是不可用的。2、引物和探針設(shè)計2.1引物設(shè)計細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計是PCR中最重要的一步。抱負(fù)的引物對只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會同擴(kuò)增其它的非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一種能夠增加特異性的引物所含有的令人滿意的特點(diǎn)：序列選用應(yīng)在基因的保守區(qū)段；擴(kuò)增片段長度根據(jù)技術(shù)的不同有所分別：sybrgreenI技術(shù)對片段長度沒有特殊規(guī)定；Taqman探針技術(shù)規(guī)定片段長度在50bp－150bp；避免引物本身或與引物之間形成4個或4個以上持續(xù)配對；避免引物本身形成環(huán)狀發(fā)卡構(gòu)造；典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，確保序列獨(dú)特性，并減少序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長度不不大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，減少了特異性，并且比短序列雜交慢，從而減少了產(chǎn)量。Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；引物之間的TM相差避免超出2℃；引物的3’端避免使用堿基A；引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上持續(xù)相似的堿基。為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計最佳能跨兩個外顯子。2.2Taqman探針設(shè)計普通設(shè)計原則：探針位置盡量地靠近上游引物；探針長度普通在25－35bp，Tm值在65－70℃，普通比引物TM高5－10℃，GC含量在40%－70%。探針的5’端應(yīng)避免使用堿基G。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。為確保引物探針的特異性，最佳將設(shè)計好的序列在blast中核算一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。(./BLAST)2.3TaqmanMGB探針設(shè)計介紹MGB探針的優(yōu)點(diǎn)：MGB探針較短(14-20bp)，更容易找到全部排序序列的較短片段的保守區(qū)。短片段探針(14-20bp)加上MGB后，Tm值將提高10℃，更容易達(dá)成熒光探針Tm值的規(guī)定。MGB探針的設(shè)計原則探針的5’端避免出現(xiàn)G，即使探針?biāo)鉃閱蝹€堿基，與報告基團(tuán)相相連的G堿基仍可淬滅基團(tuán)的熒光信號。用primerexpress軟件評價Tm值，Tm值應(yīng)為65-67℃。盡量縮短TaqmanMGB探針，但探針長度不少于13bp。盡量避免出現(xiàn)重復(fù)的堿基，特別是G堿基，應(yīng)避免出現(xiàn)4個或4個以上的G重復(fù)出現(xiàn)。原則上MGB探針只要有一種堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號)。因此，在進(jìn)行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即TaqmanMGB不與目的片段雜交，不產(chǎn)生熒光信號，探針目的片段產(chǎn)生熒光信號檢測將探針的突變位點(diǎn)盡量放在中間1/3的地方。注意：為了滿足上述規(guī)定的4個條件，探針的突變位點(diǎn)可向3’端移動，但突變位點(diǎn)最少在離3’端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守)，以進(jìn)行SNP檢測。反過來，若要進(jìn)行同類檢測，找的是保守片段區(qū)，探針中不應(yīng)有突變位點(diǎn)。若探針即便是只有13個bp,探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點(diǎn)也應(yīng)靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產(chǎn)生熒光信號。另一種辦法是設(shè)計簡并探針，也可達(dá)成即使是突變，仍可檢測到突變。2.4實時多重PCR探針的選擇：多重實時PCR的多個含意有兩種：一為選擇保守的探針和引物，運(yùn)用不同的染料標(biāo)記探針，在檢測時可根據(jù)熒光的顏色來鑒定不同的產(chǎn)物。另一種為選擇保守的引物，擴(kuò)增不同長度的目的片段，反映中加入SYBRN染料，最后根據(jù)不同目的片段的Tm值來鑒定不同的物品。多重實時PCR的熒光探針應(yīng)為同一類型：猶如時為Taqman探針、或同時為MGB探針、或同時為Beacon探針。在多重PCR中，多重PCR的各個引物之間互相干擾和各個探針之間互相干擾分析:設(shè)計好各對引物和探針后，重新在用DNAstar軟件中的Primerselect軟件，打開保守在同一文獻(xiàn)中的多重PCR的引物文獻(xiàn)，然后兩兩分別選中所設(shè)計的多重引物或兩兩分別選中所設(shè)計的多重探針后，在“report”菜單下“primerpairdimers”,分析上下游引物的dimers。彈出的窗口中就告訴此對引物有多少個dimer，并對此對引物用dG值進(jìn)行評價(普通給出最差的dG值，理論上是dG值越大越好)。3、影響PCR及熒光PCR的其它因素引物的設(shè)計和選擇符合熒光PCR的探針并進(jìn)行設(shè)計對于實時熒光PCR特別重要。能夠說，不合理的設(shè)計意味著絕對的失敗。但是，好的設(shè)計并不等于好的實驗成果，影響PCR和熒光PCR的因素非常多，下面擇其重要進(jìn)行介紹。3.1引物退火溫度引物的一種重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列體現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在抱負(fù)狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以確保引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度普通設(shè)定比引物的Tm低5℃。設(shè)定Tm有幾個公式。擬定引物Tm最可信的辦法是近鄰分析法。大部分計算機(jī)程序使用近鄰分析法——從序列一級構(gòu)造和相鄰堿基的特性預(yù)測引物的雜交穩(wěn)定性。全部oligo軟件會自動計算引物的Tm值。在設(shè)立退火溫度時能夠以下進(jìn)行：以低于估算的Tm5℃作為起始的退火溫度，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得最佳成果，兩個引物應(yīng)含有近似的Tm值。引物對的Tm差別如果超出5℃，就會由于在循環(huán)中使用較低的退火溫度而體現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，能夠在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進(jìn)行5個循環(huán)，然后再根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下能夠獲得目的模板的部分拷貝。3.2引物濃度引物的濃度會影響特異性。最佳的引物濃度普通在0.1到0.5μM。較高的引物濃度會造成非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。為了擬定引物濃度，能夠在260nm（OD260）測量光密度值。然后使用光吸取值和微摩消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD），通過Beers法則（公式1）計算引物濃度。微摩消光系數(shù)能夠使用公式2計算。與大分子雙鏈DNA能夠使用平均消光系數(shù)不同，擬定引物的精確濃度必須使用計算的消光系數(shù)。這是由于引物較短，堿基構(gòu)成差別很大。在oligo軟件上能夠計算出引物的的消光系數(shù)（OD/μmol）和消光系數(shù)的倒數(shù)（μmol/OD）。普通商業(yè)合成的引物以O(shè).D.值表達(dá)量的多少，在普通狀況下，20個堿基長的引物，1個O.D.加100ul水后引物濃度為50pmol/ul（50μM）。也能夠用OLIGO軟件，根據(jù)引物的的消光系數(shù)（OD/μmol），計算出一定的工作濃度下，引物的加水量。濃度(μM)＝A260（OD/ml）×稀釋系數(shù)×消光系數(shù)的倒數(shù)（nmol/OD）舉例：計算某寡核苷酸（溶于1ml水中），取其中的10μl稀釋100倍（加入990μl）水中。在A260處測吸光度為0.2。計算消光系數(shù)的倒數(shù)為4.8nmol/OD，代入得：濃度＝0.2（OD/ml）×100×4.8（nmol/OD）＝96nmol/ml＝96μM3.3引物、探針的純度和穩(wěn)定性定制引物的原則純度對于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。部分應(yīng)用需要純化，以除去在合成過程中的任何非全長序列。這些截斷序列的產(chǎn)生是由于DNA合成化學(xué)的效率不是100％。這是個循環(huán)過程，在每個堿基加入時使用重復(fù)化學(xué)反映，使DNA從3'到5'合成。在任何一種循環(huán)都可能失敗。較長的引物，特別是不不大于50個堿基，截斷序列的比例很大，可能需要純化。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化辦法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最佳在TE重溶引物，使其最后濃度為100μM。也能夠用雙蒸水溶解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以不不大于10μM濃度溶于TE的引物在-20℃能夠穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物能夠在-20℃保存最少1年，在室溫（15℃到30℃）最多能夠保存2個月。探針即寡核苷酸進(jìn)行熒光基團(tuán)的標(biāo)記，標(biāo)記本身有效率的區(qū)別。探針標(biāo)記后來普通應(yīng)當(dāng)純化，純度高、標(biāo)記效率高的探針不僅熒光值高，且保存時間能夠高達(dá)一年以上。不同的生物技術(shù)公司探針標(biāo)記效率和純度有很大的區(qū)別。由于重復(fù)凍融易造成探針降解，在確認(rèn)探針質(zhì)量好的狀況下，最佳稀釋成2uM（10×），作為工作濃度分裝多支，避光保存。3.4熱啟動熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的辦法之一。盡管TaqDNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反映配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計的位點(diǎn)由于遺傳元件的定位而受限時，如定點(diǎn)突變、體現(xiàn)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動PCR尤為有效。限制TaqDNA聚合酶活性的慣用辦法是在冰上配制PCR反映液，并將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種辦法簡樸便宜，但并不能完全克制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。熱啟動通過克制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)成變性溫度。涉及延緩加入TaqDNA聚合酶在內(nèi)的大部分手工熱啟動辦法十分煩瑣，特別是對高通量應(yīng)用。其它的熱啟動辦法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，如鎂離子或酶，包裹起來，或者將反映成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把多個成分釋放出來并混合在一起。象手動熱啟動辦法同樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不合用于于高通量應(yīng)用。Transitor?HotStartTaq酶對于自動熱啟動PCR來說高效可靠。Transitor?HotStartTaq是在常規(guī)Taq酶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了化學(xué)修飾，使得該酶在低溫或常溫下沒有酶活，因此在加樣至PCR擴(kuò)增前，不會產(chǎn)生由于引物隨機(jī)粘連而形成的非特異性擴(kuò)增。高溫條件下，化學(xué)修飾集團(tuán)會被剪切，從而釋放酶活。另外，隨著PCR擴(kuò)增的進(jìn)行，酶活會被逐步釋放，有效提高擴(kuò)增效率及產(chǎn)物量。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶在變性環(huán)節(jié)的95℃保溫過程中要持續(xù)20分鐘才會被釋放到反映中，從而完全恢復(fù)聚合酶活性。3.5鎂離子濃度鎂離子影響PCR的多個方面，如DNA聚合酶的活性，這會影響產(chǎn)量；再如引物退火，這會影響特異性。dNTP和模板同鎂離子結(jié)合，減少了酶活性所需要的游離鎂離子的量。最佳的鎂離子濃度對于不同的引物對和模板都不同，但是包含200μMdNTP的實時定量PCR，使用3到5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液（普通PCR是1.5mM）。較高的游離鎂離子濃度能夠增加產(chǎn)量，但也會增加非特異性擴(kuò)增，減少忠實性。為了擬定最佳濃度，普通PCR從1mM到3mM，以0.5mM遞增，進(jìn)行鎂離子滴定。為減少對鎂離子優(yōu)化的依賴，能夠使用Transitor?HotStartTaq酶。Transitor?HotStartTaqDNA聚合酶能夠在比普通的TaqDNA聚合酶更廣的鎂離子濃度范疇內(nèi)保持功效，因此僅需較少的優(yōu)化。3.6模板質(zhì)量模板的質(zhì)量會影響產(chǎn)量。DNA樣品中發(fā)現(xiàn)有多個污染物會克制PCR。某些在原則基因組DNA制備中使用的試劑，如SDS，在濃度低至0.01％時就會克制擴(kuò)增反映。分離基因組DNA較新的辦法涉及了DNAZol，一種胍去垢劑裂解液，以及FTAGeneGuardSystem，其能夠同基質(zhì)結(jié)合，在血液及其它生物樣品中純化貯存DNA。應(yīng)注意進(jìn)行PCR反映的模板質(zhì)量，以增加PCR反映的成功率。3.7模板濃度起始模板的量對于獲得高產(chǎn)量很重要。對大多數(shù)PCR擴(kuò)增和熒光PCR擴(kuò)增，104到106個起始目的分子就足以觀察到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大?。ㄏ卤恚Ｅe例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相稱于3×104到3×105個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于普通的檢測樣品，10－100ng的量就足夠檢測了。固然對模板做一種梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴(kuò)增效率。表1.基因組大小和分子數(shù)目的比例基因組DNA

Size(bp)*

TargetMolecules/μgofGenomicDNA

AmountofDNA(μg)for-10^5MoleculesE.coli

4.7×10^6

1.8×10^8

0.001Saccharomycescerevisiae

2.0×10^7

4.5×10^7

0.01Arabidopsisthaliana

7.0×10^7

1.3×10^7

0.01Drosophilamelanogaster

1.6×10^8

6.6×10^5

0.5Homosapiens

2.8×10^9

3.2×10^5

1.0Xenopuslaevis

2.9×10^9

3.1×10^5

1.01.0Musmusculus

3.3×10^9

2.7×10^5

1.0Zeamays

1.5×10^10

6.0×10^4

2.0pUC18plasmidDNA

2.69×10^3

3.4×10^11

1×10^(-6)3.8避免殘存（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，由于它是一種敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染能夠與目的模板一塊被擴(kuò)增?，F(xiàn)在一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來進(jìn)行新的擴(kuò)增反映時，會發(fā)生共同來源的污染。這稱之為殘存污染。從其它樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘存污染）。能夠在PCR過程中使用良好的實驗環(huán)節(jié)減少殘存污染。使用帶濾芯的移液管能夠制止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反映前更換手套?？偸鞘褂貌缓心０宓年幮詫φ諜z測污染。使用預(yù)先混合的反映成分，而不是每個反映的每個試劑單獨(dú)加入。一種避免殘存污染的辦法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴(kuò)增過程中將脫氧尿嘧啶替代為胸腺嘧啶使得能夠把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA分辨開來。由于前面的擴(kuò)增產(chǎn)物對UDG敏感，全部能夠在PCR前對新配制的反映用UDG解決以破壞殘存產(chǎn)物熒光定量PCR實驗指南（二）1、高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系影響PCR的因素如此之多，您有時很難分辨是什么造成您的實驗成果不佳。減少實驗的不穩(wěn)定因素是使用優(yōu)質(zhì)可靠的產(chǎn)品。使用優(yōu)質(zhì)、性能可靠的熱啟動酶、優(yōu)質(zhì)的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統(tǒng)預(yù)混成的定量PCR試劑體系，最大程度的減少了反映變量，提高了實驗的可重復(fù)性和可靠性。您還需要進(jìn)行下列環(huán)節(jié)的準(zhǔn)備：設(shè)計引物和探針、合成引物和探針、對的儲藏、得到高質(zhì)量的模板，隨即，您僅需要進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化，就能得到好的實驗成果。FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）同競爭對手的定量PCR體系相比提供了更優(yōu)秀的成果。使用這種產(chǎn)品，您能夠在您的PCR中得到更加好特異性和更高的敏捷度，同時能夠靈活地選擇您所喜歡的擴(kuò)增條件，檢測辦法和設(shè)備。實時定量PCR是快速增加的PCR辦法，它能夠精確、可重復(fù)地定量起始物質(zhì)。FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）是一種方便使用的反映混合液，為定量分析進(jìn)行了優(yōu)化。它包含了熒光PCR所必須的成分（如緩沖液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記探針。您就能夠得到實時qPCR所需的特異性和靈活性。您能夠運(yùn)用成套的hotstartTaq酶kit(AA0106)，來配制不含有UNG/dUTP防污染系統(tǒng)的熱啟動熒光PCR體系。您也能夠選擇hotstartTaq酶，UNG酶和dNTPS,來配制含有UNG/dUTP防污染系統(tǒng)的熱啟動熒光PCR體系。您能夠從實驗角度得到多個選擇，得到高產(chǎn)量、特異和靈活的定量PCR試劑體系！高產(chǎn)量和特異性的擴(kuò)增FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart）提供了強(qiáng)大的PCR擴(kuò)增，能夠使用多個模板組。所使用的TaqDNA聚合酶含有熱啟動特性。這極大地減少和消除了錯誤配對和非特異性擴(kuò)增，使您得到較高產(chǎn)量，并增加特異性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）避免殘存污染的能力避免了非模板DNA的擴(kuò)增，從而減少了假陽性，使成果更可靠。在產(chǎn)量和敏捷度方面，QuantitativePCRMASTERMix-UDG（hotstart）的敏捷度極高（閾循環(huán)）。您能夠更精確地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范疇內(nèi)檢測線性劑量反映。高度靈活性除了敏捷度和特異性外，UniversalPCRMasterMixKit在分析設(shè)立，檢測辦法和設(shè)備上給您提供了較高的自由度。使用UniversalPCRMasterMixKit，您能夠：對擴(kuò)增的不同模板優(yōu)化鎂離子濃度，由于提供了附加的氯化鎂，因此您能夠方便地配備Mix體系。能夠更靈活的進(jìn)行普通PCR和熒光PCR。能夠在多個設(shè)備上使用，如ABIPrism?7700,ABIGeneAmp?5700和Bio-Rad的I-Cycler。能夠運(yùn)用多個檢測辦法的優(yōu)點(diǎn)，涉及TaqMan?探針和MolecularBeacon，您不必局限于特定的試劑盒。您還能夠靈活的選擇進(jìn)行自配熒光PCR體系，不管是含UNG/dUTP防污染系統(tǒng)還是不含該系統(tǒng)的。2、反映體系配制：AA0101試劑盒：（探針體系）FQ-PCRMasterMix-UNG混合物(2X)25ul（終濃度為1×）；上游引物（終濃度為50~900nM）（可先設(shè)200nM），下游引物（終濃度為50~900nM）（可先設(shè)200nM）；探針（終濃度為200nM）；待檢樣品5ul（終濃度為10~100ng）；無菌去離子水補(bǔ)足，使總體積達(dá)成50ul。您能夠選擇熒光染料SYBGREEN體系，具體請參考闡明書。您可靈活使用20-50ul間其它體積，注意確保終濃度相似。AA0106試劑盒:反映體系終濃度(自配熱啟動熒光系統(tǒng))：1-2U的hotstartTaq酶、3-5.5mM的Mg2+、0.2mM的dNTPs、1×PCRbuffer（AA0106）；50－900nM的上游引物（可先設(shè)200nM）、50－900nM的下游引物（可先設(shè)200nM）、200nM的探針、普通取2-5ul的模板,無菌去離子水補(bǔ)足，反映總體積普通為20－50ul自配熱啟動熒光－UNG體系：1-2U的Taq酶、1×PCRbuffer、2.5-4.0mM的Mg2+（AA0105）；0.2-1U的UNG酶(AA0107)（可先設(shè)為0.5U）、0.2mM的d(A,C,G)TPs、0.2-0.4mMdUTP（要調(diào)節(jié)）(AA0108)；50－900nM的上游引物（可先設(shè)200nM）、50－900nM的下游引物（可先設(shè)200nM）、200nM的探針、普通取2-5ul的模板、反映總體積普通為20－50ul3、反映體系和條件的優(yōu)化:使用高產(chǎn)量，特異和靈活的定量PCR試劑體系FQPCRMASTERMix-UDG（hotstart），優(yōu)化參數(shù)最少。您只需要優(yōu)化退火溫度，就能夠得到更敏捷、更可靠的定量成果。對于特殊構(gòu)造的熒光PCR，您能夠優(yōu)化引物濃度，來得到更特異或更敏捷的成果。使用通用PCRMasterMix試劑盒進(jìn)行反映體系的配制，能夠適合更多的反映體系，如mRNA的普通RT-PCR檢測，合用于合成質(zhì)粒的PCR，同時也合用于熒光PCR，范疇更寬。采用成套的hotstartTaq酶kit(AA0106)，該試劑盒中含有進(jìn)行熱啟動熒光核心試劑盒的全部成分，也減少了選擇純度不夠或不適宜產(chǎn)品的風(fēng)險。您需要根據(jù)下列原則進(jìn)行優(yōu)化：1、您需要對酶量和鎂離子濃度進(jìn)行優(yōu)化。酶的推薦反映濃度為1.25－1.5U（50ul），必要時可在1-2U之間探討酶的最佳條件；Mg離子推薦濃度普通PCR終濃度為1－3mM,熒光PCR終濃度為3－5.5mM，請在該范疇內(nèi)探討最佳條件。2、試劑盒中提供的dNTP已經(jīng)預(yù)混，能夠充足確保產(chǎn)品質(zhì)量和PCR的忠實性。dNTP選擇典型的0.2mM的濃度即可。3、另外，上游引物和下游引物濃度可先設(shè)為200nM。當(dāng)成果不抱負(fù)時，能夠在50nM－900nM之間進(jìn)行探討。4、如選用Taqman探針，探針濃度可設(shè)為200nM，不須探討。選擇其它種類的探針需根據(jù)規(guī)定設(shè)立探針濃度。5、能夠先用推薦的反映條件，如果成果不佳，可根據(jù)引物、探針設(shè)計的具體狀況適合的退火溫度，退火時間和循環(huán)數(shù)。6、DNA模板的添加量普通在100ng下列，因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進(jìn)行梯度稀釋，擬定最佳的DNA模板添加量。