微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)生物工程學(xué)院編9月目錄第一部分基本知識(shí)課程目的與任務(wù)學(xué)生實(shí)驗(yàn)守則微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室慣用的器皿微生物實(shí)驗(yàn)室慣用顯微鏡微生物實(shí)驗(yàn)室慣用消毒滅菌辦法第二部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一環(huán)境微生物的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)二光學(xué)顯微鏡的使用實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的單染實(shí)驗(yàn)四革蘭氏染色法實(shí)驗(yàn)五細(xì)菌芽孢染色法實(shí)驗(yàn)六培養(yǎng)基的配制和滅菌實(shí)驗(yàn)七微生物的直接鏡檢記數(shù)法基本接種辦法與重要微生物菌落形態(tài)的觀察實(shí)驗(yàn)八微生物的培養(yǎng)特性實(shí)驗(yàn)九微生物的分離純化實(shí)驗(yàn)十大腸桿菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)十一厭氧菌的培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)十二菌種保藏法第三部分應(yīng)用實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十三大分子物質(zhì)的水解實(shí)驗(yàn)十四抗生素效價(jià)的生物測(cè)定實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十五IMVIC與硫化氫實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)十六微量簡(jiǎn)易診檢系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)十七吞噬作用實(shí)驗(yàn)十八抗原與免疫血清的制備實(shí)驗(yàn)十九牛乳中細(xì)菌的檢查實(shí)驗(yàn)二十牛乳在自然發(fā)酵與酸敗過(guò)程中細(xì)菌的生態(tài)學(xué)演變酸奶發(fā)酵過(guò)程的分析檢測(cè)第四部分附錄附錄I染色液的配制附錄Ⅱ培養(yǎng)基的配制附錄Ⅲ試劑和溶液的配制附錄IVDIGLIB2.0使用手冊(cè)課程目的和任務(wù)本課程的目的：訓(xùn)練學(xué)生掌握微生物學(xué)最基本的操作技能；理解微生物學(xué)的基本知識(shí)；加深理解課堂講授的某些微生物學(xué)理論。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力；實(shí)事求是、嚴(yán)肅認(rèn)真的科學(xué)態(tài)度以及勤儉節(jié)省、愛(ài)惜公物的良好作風(fēng)。本課程的重要任務(wù)：1、掌握顯微鏡的基本構(gòu)造，并能對(duì)的、純熟操作。2、通過(guò)對(duì)細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌等微生物的個(gè)體形態(tài)及菌落特性的觀察，掌握對(duì)它們進(jìn)行初步鑒別的知識(shí)。3、掌握慣用的幾個(gè)微生物接種以及菌種保存的基本辦法。4、微生物單染及革蘭氏染色辦法，以及其在微生物鑒別上的應(yīng)用5、掌握培養(yǎng)基的配制與滅菌、純種分離、以及微生物的鏡檢計(jì)數(shù)等基本技能。6、掌握菌落總數(shù)、細(xì)菌總數(shù)及微生物增殖曲線的測(cè)定辦法，以及在發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。學(xué)生實(shí)驗(yàn)守則每次實(shí)驗(yàn)前必須對(duì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行充足預(yù)習(xí)，以理解實(shí)驗(yàn)的目的、原理和辦法，做到心中有數(shù)，思路清晰。認(rèn)真及時(shí)做好實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，對(duì)于當(dāng)時(shí)不能得到成果而需要持續(xù)觀察的實(shí)驗(yàn)，則需記下每次觀察的現(xiàn)象和成果，方便分析。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)保持整潔，勿高聲談話和隨便走動(dòng)，保持室內(nèi)安靜。實(shí)驗(yàn)時(shí)小心認(rèn)真，全部操作應(yīng)嚴(yán)格按操作規(guī)程進(jìn)行，萬(wàn)一遇有盛菌試管或瓶不慎打破、皮膚破傷或菌液吸入口中檔意外狀況發(fā)生時(shí)，應(yīng)立刻報(bào)告指導(dǎo)教師，及時(shí)解決，切勿隱瞞。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃藥品靠近火焰。如遇火險(xiǎn)，應(yīng)先關(guān)掉火源，再用濕布或沙土掩蓋滅火。必要時(shí)用滅火機(jī)。使用顯微鏡或其它貴重儀器時(shí)，規(guī)定細(xì)心操作，特別愛(ài)惜。對(duì)消耗材料和藥品等要力求節(jié)省，用畢后仍放回原處。每次實(shí)驗(yàn)完畢后，必須把所用儀器抹凈放妥，將實(shí)驗(yàn)室收拾整潔，擦凈桌面，如有菌液污染桌面或其它地方時(shí)，可用3％來(lái)蘇爾液或5％石炭酸液覆蓋其上半小時(shí)后擦去，如系芽孢桿菌，應(yīng)適宜延長(zhǎng)消毒時(shí)間。凡帶菌之工具（如吸管、玻璃刮棒等）在洗滌前須浸泡在3％來(lái)蘇爾液中進(jìn)行消毒。每次實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行培養(yǎng)的材料，應(yīng)標(biāo)明自己的組別及解決辦法，放于教師指定的地點(diǎn)進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室中的菌種和物品等，未經(jīng)教師許可，不得攜出室外。每次實(shí)驗(yàn)的成果，應(yīng)以實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度填入報(bào)告表格中，力求簡(jiǎn)要精確，并連同思考題及時(shí)匯交教師批閱。離實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)將手洗凈，注意關(guān)閉門窗、燈、火、煤氣等。微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室慣用的器皿微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用的玻璃器皿，大多要進(jìn)行消毒、滅菌和用來(lái)培養(yǎng)微生物，因此對(duì)其質(zhì)量、洗滌和包裝辦法都有一定的規(guī)定。普通，玻璃器皿的質(zhì)量規(guī)定硬質(zhì)玻璃，才干承受高溫和短暫燒灼而不致破損；器皿的游離堿含量要少，否則會(huì)影響培養(yǎng)基的酸堿度；對(duì)玻璃器皿的形狀和包裝辦法的規(guī)定，以能避免污染雜菌為準(zhǔn)；洗滌辦法不恰當(dāng)也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)成果。本節(jié)將對(duì)這幾方面作具體介紹。一、器皿的種類、規(guī)定與應(yīng)用1．試管（testtube）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用玻璃試管，其管壁必須比化學(xué)實(shí)驗(yàn)室用的厚些，這樣在塞棉花塞時(shí)，管口才不會(huì)破損。試管的形狀規(guī)定沒(méi)有翻口（圖Ⅰ-1，A），否則，微生物容易從棉塞與管口的縫隙間進(jìn)入試管（圖Ⅰ-1，B）而造成污染。另外，現(xiàn)在有不用棉塞而用鋁制或塑料制的試管帽（圖Ⅰ-1，C），若用翻口試管也不便于蓋試管帽。有的實(shí)驗(yàn)規(guī)定盡量減低蒸發(fā)試管內(nèi)的水分，則需使用螺口試管（圖Ⅰ-1，D），蓋以螺口膠木或塑料帽。試管的大小可根據(jù)用途的不同，準(zhǔn)備下列三種型號(hào)。（1）大試管（約18×180mm）可盛倒培養(yǎng)皿用的培養(yǎng)基；亦可作制備瓊脂斜面用（需要大量菌體時(shí)用）。（2）中試管（約13—15×100—150mm）盛液體培養(yǎng)基或做瓊脂斜面用，亦可用于病毒等的稀釋和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。（3）小試管（10—12×100mm）普通用于糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)或血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，和其它需要節(jié)省材料的實(shí)驗(yàn)2．德漢氏試管（Durhamtube）觀察細(xì)菌在糖發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)產(chǎn)氣狀況時(shí)，普通在小試管內(nèi)再套一倒置的小套管（約6×36mm）（圖I-2），此小套管即為德漢氏試管，又稱發(fā)酵小套管。3．吸管（又稱移液管，pipette）（1）玻璃吸管（glasspipette）微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室普通要準(zhǔn)備1、5、10ml的刻度玻璃吸管（圖I-3，A）。與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用的不同，其刻度批示的容量往往涉及管尖的液體體積，亦即使用時(shí)要注意將所吸液體吹盡，故有時(shí)稱為“吹出”吸管。市售細(xì)菌學(xué)用吸管，有的在吸管上端刻有“吹”字。除有刻度的吸管外，有時(shí)需用不計(jì)量的毛細(xì)吸管，又稱滴管（圖Ⅰ-3，B），來(lái)吸取動(dòng)物體液和離心上清液以及滴加少量抗原、抗體等。（2）活塞吸管（pistonpipette）重要用來(lái)吸取微量液體，故又稱微量吸液器或微量加樣器。其外形和構(gòu)造如圖Ⅰ-4，除塑料外殼外，重要部件有按鈕、彈簧、活塞和可裝卸的吸嘴。按動(dòng)按鈕，通過(guò)彈簧使活塞上下活動(dòng)，從而吸進(jìn)和放出液體。其特點(diǎn)是容量固定，使用時(shí)不用觀察刻度，操作方便、快速。國(guó)內(nèi)產(chǎn)品普通每個(gè)活塞吸管固定一種容量，分別有5、10、20、25、50、100、200、500、1000μl等不同容量。而精制的活塞吸管每個(gè)在一定的范疇內(nèi)可調(diào)節(jié)幾個(gè)容積，例如在5—25μl的范疇內(nèi)，可調(diào)節(jié)5、10、15、20、25μl五個(gè)不同的量，使用時(shí)按需要調(diào)節(jié)，但當(dāng)調(diào)節(jié)固定后，每吸一次，容量仍是固定的。用畢只需調(diào)換吸嘴或?qū)⑽煜磧?，消毒后再行使用?；钊苁菄?guó)外70年代后半期才開始生產(chǎn)與應(yīng)用的，近年來(lái)國(guó)內(nèi)亦日益廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)和使用同位素等的科學(xué)實(shí)驗(yàn)中。4．培養(yǎng)皿（petridish）慣用的培養(yǎng)皿（圖Ⅰ-5），皿底直徑90mm，高15mm。培養(yǎng)皿普通均為玻璃皿蓋，但有特殊需要時(shí)，可使用陶器皿蓋，因其能吸取水分，使培養(yǎng)基表面干燥，例如測(cè)定抗生素生物效價(jià)時(shí)，培養(yǎng)皿不能倒置培養(yǎng)，則用陶器皿蓋為好。在培養(yǎng)皿內(nèi)倒入適量固體培養(yǎng)基制成平板，用于分離、純化、鑒定菌種、微生物計(jì)數(shù)以及測(cè)定抗生素、噬菌體的效價(jià)等。5．三角燒瓶（Erlenmeyerflask）與燒杯（beaker）三角燒瓶有100、250、500、1000ml等不同的大小，慣用來(lái)盛無(wú)菌水、培養(yǎng)基和搖瓶發(fā)酵等。慣用的燒杯有50、100、250、500、1000ml等，用來(lái)配制培養(yǎng)基與藥品。6．注射器（injector）普通有1、2、5、10、20、50ml等不同容量的注射器。注射抗原于動(dòng)物體內(nèi)可根據(jù)需要使用1、2和5ml的；抽取動(dòng)物心臟血或綿羊靜脈血可采用10、20、50ml的。微量注射器有10、20、50、100μl等不同的大小。普通在免疫學(xué)或紙層析等實(shí)驗(yàn)中滴加微量樣品時(shí)應(yīng)用。7．載玻片（slide）與蓋玻片（coverslip）普通載玻片大小為75×25mm，用于微生物涂片、染色，作形態(tài)觀察等。蓋玻片為18×18mm。凹玻片是在一塊厚玻片的當(dāng)中有一圓形凹窩（圖Ⅰ-6），作懸滴觀察活細(xì)菌以及微室培養(yǎng)用。8．雙層瓶（doublebottle）由內(nèi)外兩個(gè)玻璃瓶構(gòu)成（圖Ⅰ-7），內(nèi)層小錐形瓶盛放香柏油，供油鏡頭觀察微生物時(shí)使用，外層瓶盛放二甲苯，用以擦凈油鏡頭。9．滴瓶（dropperbottle）用來(lái)裝多個(gè)染料、生理鹽水等（圖Ⅰ-8）。10．接種工具圖３－３接種和分離工具1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀接種工含有接種環(huán)（inoculatingloop）、接種針（inocula-tingneedle）、接種鉤（inoculatinghook）、接種鏟（inocula-tingshovel）、玻璃涂布器（glassspreader）等（圖Ⅰ-9）。制造環(huán)、針、鉤、鏟的金屬可用鉑或鎳，原則是軟硬適度，能經(jīng)受火焰重復(fù)燒灼，又易冷卻。接種細(xì)菌和酵母菌用接種環(huán)和接種針，其鉑絲或鎳絲的直徑以0．5mm為適宜，環(huán)的內(nèi)徑約2mm，環(huán)面應(yīng)平整。接種某些不易和培養(yǎng)基分離的放線菌和真菌，有時(shí)用接種鉤或接種鏟，其絲的直徑規(guī)定粗某些，約1mm。用涂布法在瓊脂平板上分離單個(gè)菌落時(shí)需用玻璃涂布器，是將玻棒彎曲或?qū)⒉０粢欢藷t后壓扁而成。二、玻璃器皿的清洗辦法清潔的玻璃器皿是實(shí)驗(yàn)得到對(duì)的成果的先決條件，因此，玻璃器皿的清洗是實(shí)驗(yàn)前的一項(xiàng)重要準(zhǔn)備工作。清洗辦法根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、器皿的種類、所盛放的物品、洗滌劑的類別和沾污程度等的不同而有所不同。現(xiàn)分述以下：1．新玻璃器皿的洗滌辦法新購(gòu)置的玻璃器皿含游離堿較多，應(yīng)在酸溶液內(nèi)先浸泡數(shù)小時(shí)。酸溶液普通用2％的鹽酸或洗滌液（見(jiàn)本小節(jié)“3”）。浸泡后用自來(lái)水沖洗干凈。2．使用過(guò)的玻璃器皿的洗滌辦法(1)試管、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、燒杯等可用瓶刷或海綿沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗滌劑刷洗，然后用自來(lái)水充足沖洗干凈。熱的肥皂水去污能力更強(qiáng)，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉較難沖洗干凈而常在器壁上附有一層微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充足沖洗，或可用稀鹽酸搖洗一次，再用水沖洗，然后倒置于鐵絲框內(nèi)或有空心格子的木架（圖Ⅰ-10）上，在室內(nèi)晾干。急用時(shí)可盛于框內(nèi)或搪瓷盤上，放烘箱烘干。玻璃器皿經(jīng)洗滌后，若內(nèi)壁的水是均勻分布成一薄層，表達(dá)油垢完全洗凈，若掛有水珠，則還需用洗滌液浸泡數(shù)小時(shí)，然后再用自來(lái)水充足沖洗。裝有固體培養(yǎng)基的器皿應(yīng)先將其刮去，然后洗滌。帶菌的器皿在洗滌前先浸在2％煤酚皂溶液（來(lái)蘇爾）或0．25％新潔爾滅消毒液內(nèi)24小時(shí)或煮沸半小時(shí)，再用上法洗滌。帶病原菌的培養(yǎng)物最佳先行高壓蒸汽滅菌，然后將培養(yǎng)物倒去，再進(jìn)行洗滌。盛放普通培養(yǎng)基用的器皿經(jīng)上法洗滌后，即可使用，若需精確配制化學(xué)藥品，或做科研用的精確實(shí)驗(yàn)，規(guī)定自來(lái)水沖洗干凈后，再用蒸餾水淋洗三次，晾干或烘干后備用。(2)玻璃吸管吸過(guò)血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管（涉及毛細(xì)吸管），使用后應(yīng)立刻投入盛有自來(lái)水的量筒或標(biāo)本瓶?jī)?nèi)，免得干燥后難以沖洗干凈。量筒或標(biāo)本瓶底部應(yīng)墊以脫脂棉花，否則吸管投入時(shí)容易破損。待實(shí)驗(yàn)完畢，再集中沖洗。若吸管頂部塞有棉花，則沖洗前先將吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，用水將棉花沖出，然后再裝入吸管自動(dòng)洗滌器內(nèi)沖洗，沒(méi)有吸管自動(dòng)洗滌器的實(shí)驗(yàn)室可用沖出棉花的辦法多沖洗半晌。必要時(shí)再用蒸餾水淋洗。洗凈后，放搪瓷盤中晾干，若要加速干燥，可放烘箱內(nèi)烘干。吸過(guò)含有微生物培養(yǎng)物的吸管亦應(yīng)立刻投入盛有2％煤酚皂溶液或0．25％新潔爾滅消毒液的量筒或標(biāo)本瓶?jī)?nèi)，24小時(shí)后方可取出沖洗。吸管的內(nèi)壁如果有油垢，同樣應(yīng)先在洗滌液內(nèi)浸泡數(shù)小時(shí)，然后再行沖洗。(3)載玻片與蓋玻片用過(guò)的載玻片與蓋玻片如滴有香柏油，要先用皺紋紙擦去或浸在二甲苯內(nèi)搖晃幾次，使油垢溶解，再在肥皂水中煮沸5—10分鐘，用軟布或脫脂棉花擦試，立刻用自來(lái)水沖洗，然后在稀洗滌液中浸泡0．5—2小時(shí)，自來(lái)水沖去洗滌液，最后用蒸餾水換洗多次，待干后浸于95％酒精中保存?zhèn)溆?。使用時(shí)在火焰上燒去酒精。用此法洗滌和保存的載玻片和蓋玻片清潔透亮，沒(méi)有水珠。檢查過(guò)活菌的載玻片或蓋玻片應(yīng)先在2％煤酚皂溶液或0．25％新潔爾滅溶液中浸泡24小時(shí)，然后按上法洗滌與保存。3．洗滌液的配制與使用（1）洗滌液的配制洗滌液分濃溶液與稀溶液兩種，配方以下：濃溶液重鉻酸鈉或重鉻酸鉀（工業(yè)用）50g自來(lái)水150ml濃硫酸（工業(yè)用）800ml稀溶液重鉻酸鈉或重鉻酸鉀（工業(yè)用）50g自來(lái)水850ml濃硫酸（工業(yè)用）100ml配法都是將重鉻酸鈉或重鉻酸鉀先溶解于自來(lái)水中，可慢慢加溫，使溶解，冷卻后漸漸加入濃硫酸，邊加邊攪動(dòng)。配好后的洗滌液應(yīng)是棕紅色或桔紅色。貯存于有蓋容器內(nèi)。（2）原理重鉻酸鈉或重鉻酸鉀與硫酸作用后形成鉻酸（chro-micacid），酪酸的氧化能力極強(qiáng)，因而此液含有極強(qiáng)的去污作用。（3）使用注意事項(xiàng)（a）洗滌液中的硫酸含有強(qiáng)腐蝕作用，玻璃器皿浸泡時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使玻璃變質(zhì)，因此切忌屆時(shí)忘記將器皿取出沖洗。另首先，洗滌液若沾污衣服和皮膚應(yīng)立刻用水洗，再用蘇打水或氨液洗。如果濺在桌椅上，應(yīng)立刻用水洗去或濕布抹去；（b）玻璃器皿投入前，應(yīng)盡量干燥，避免洗滌液稀釋；（c）此液的使用僅限于玻璃和瓷質(zhì)器皿，不合用于金屬和塑料器皿；（d）有大量有機(jī)質(zhì)的器皿應(yīng)先行擦洗，然后再用洗滌液，這是由于有機(jī)質(zhì)過(guò)多，會(huì)加緊洗滌液失效，另外，洗滌液雖為很強(qiáng)的去污劑，但也不是全部的污跡都可去除；（e）盛洗滌液的容器應(yīng)始終加蓋，以防氧化變質(zhì)；（f）洗滌液可重復(fù)使用，但當(dāng)其變?yōu)槟G色時(shí)即已失效，不能再用。三、空玻璃器皿的包裝1．培養(yǎng)皿的包裝培養(yǎng)皿慣用舊報(bào)紙密密包緊，普通以5—8套培養(yǎng)皿作一包，少于5套工作量太大，多于8套不易操作。包好后行于熱滅菌。如將培養(yǎng)皿放入銅筒內(nèi)進(jìn)行干熱滅菌，則不必用紙包，銅筒有一圓筒形的帶蓋外筒，里面放一裝培養(yǎng)皿的帶底框架（圖Ⅰ-11），此框架可自圓筒內(nèi)提出，方便裝取培養(yǎng)皿。2．吸管的包裝準(zhǔn)備好干燥的吸管，在距其粗頭頂端約0．5cm處，塞一小段約1．5cm長(zhǎng)的棉花，以免使用時(shí)將雜菌吹入其中，或不慎將微生物吸出管外。棉花要塞得松緊恰當(dāng)，過(guò)緊，吹吸液體太費(fèi)力；過(guò)松，吹氣時(shí)棉花會(huì)下滑。然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報(bào)紙條的近左端，與報(bào)紙約呈45度角（圖I-12），并將左端多出的一段紙覆折在吸管上，再將整根吸管卷入報(bào)紙，右端多出的報(bào)紙打一小結(jié)。如此包好的諸多吸管可再用一張大報(bào)紙包好，進(jìn)行干熱滅菌。如果有裝吸管的銅筒（圖Ⅰ-13），亦可將分別包好的吸管一起裝入銅筒，進(jìn)行干熱滅菌；若預(yù)計(jì)一筒滅菌的吸管可一次用完，亦可不用報(bào)紙包而直接裝入銅筒滅菌，但規(guī)定將吸管的尖端插入筒底，粗端在筒口，使用時(shí)，銅筒臥放在桌上，用手持粗端拔出。3．試管和三角燒瓶等的包裝試管管口和三角燒瓶瓶口塞以棉花塞（做棉塞的辦法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)六），然后在棉花塞與管口和瓶口的外面用兩層報(bào)紙（不可用油紙）與細(xì)線包扎好，進(jìn)行干熱滅菌。試管塞好棉花塞后也可一起裝在鐵絲簍中，用大張報(bào)紙將一簍試管口做一次包扎，包紙的目的在于保存期避免灰塵侵入?？盏牟Ａ髅笃胀ㄓ酶蔁釡缇?，若需濕熱滅菌，則要多用幾層報(bào)紙包扎，外面最佳再加一層牛皮紙。如果試管是蓋的鋁帽，則不必包紙，可直接干熱滅菌。用塑料帽，則宜濕熱滅菌。微生物實(shí)驗(yàn)室慣用顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分構(gòu)成，具體介紹見(jiàn)實(shí)驗(yàn)二暗視野光學(xué)顯微鏡生活的細(xì)菌在明視野顯微鏡下觀察是透明的，不易看清。暗視野顯微鏡的原理與來(lái)自縫隙的一束強(qiáng)光通過(guò)暗室時(shí)，可清晰地看到其中細(xì)微灰塵的現(xiàn)象是同樣的，即給樣品照明的光不直接穿過(guò)物鏡，而是由樣品上反射或折射的光進(jìn)入物鏡，那么，在漆黑的視野中，由于反差增大了，使樣品能夠看得更清晰。因用暗視野法能夠在黑暗的視野中看到光亮的菌體，故在觀察生活細(xì)菌及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)時(shí)常采用此法。暗視野顯微鏡的構(gòu)造重要是采用一種特殊的聚光器，在聚光器的下方中央為圓形黑盤所遮，光僅由周緣進(jìn)入，使光會(huì)聚于載玻片上，并斜照物體，物體經(jīng)斜射照明后，發(fā)出反射光可進(jìn)入物鏡，這樣，造成顯微鏡視野黑暗，而其中的物體明亮。如無(wú)暗視野顯微鏡時(shí)，只需將明視野顯微鏡上的聚光器取下，換上暗視野聚光器即可；也可在明視野顯微鏡聚光器下面的濾光鏡支架上放一片星形擋板（stardiaphragm）（圖Ⅲ-6）構(gòu)成暗視野，這種辦法合用于低倍鏡觀察。在暗視野中，由于有些活細(xì)胞其外表比死細(xì)胞明亮，因此暗視野也被用來(lái)分辨死、活細(xì)胞，此技術(shù)現(xiàn)已被用于多個(gè)酵母細(xì)胞的死、活鑒別。另外，暗視野顯微鏡對(duì)于觀察嬌弱的微生物，如梅毒密螺旋體（Treponemapallidum）特別有用。三、相差顯微鏡暗視野顯微鏡能夠看到活細(xì)胞的外部形態(tài)，但是看不清內(nèi)部構(gòu)造。相差顯微鏡不僅能觀察活細(xì)胞的形態(tài)，并且還能看到細(xì)胞內(nèi)部構(gòu)造以及細(xì)胞分裂的持續(xù)過(guò)程。光線通過(guò)透明物體如活細(xì)菌細(xì)胞后，由于受透明物體中密度和折射率不同的物質(zhì)的影響，部分光線變成了繞射光，光波的相位發(fā)生變化，而這種相位差不體現(xiàn)為明暗和顏色上的差別，不能在顯微鏡視野中觀察到。相差顯微鏡就是將通過(guò)透明物體的直射光延遲或提前，并和繞射光產(chǎn)生干涉，使相位差變?yōu)檎穹?。如果產(chǎn)生的干涉為相長(zhǎng)干涉（圖Ⅲ-8，R組光線），則振幅的同相量相加而變大，我們便看到較亮的部分；如果所產(chǎn)生的干涉為相消干涉時(shí)（如圖Ⅲ-8，S組光線），則振幅異相量相消而變小，這部分就變得較暗。這樣，變相位差為振幅差的成果，使原來(lái)透明的物體體現(xiàn)出明顯的明暗差別，對(duì)比度增加，能更清晰地觀察活細(xì)胞的細(xì)微構(gòu)造。相差顯微鏡成像原理和裝置如圖Ⅲ-9所示。在普通光學(xué)顯微鏡上增加下列四種附件就成為相差顯微鏡：（1）環(huán)狀光闌相差顯微鏡的聚光鏡光闌是環(huán)狀光闌。照明光線只能從環(huán)狀的透明區(qū)進(jìn)入聚光鏡再斜射到標(biāo)本上（斜射角度遠(yuǎn)不大于暗視野聚光鏡）。大小不同的環(huán)狀光闌成一轉(zhuǎn)盤（圖Ⅲ-10，A），安裝于聚光鏡下面，更換放大率不同的物鏡時(shí)，要同時(shí)更換與其對(duì)應(yīng)的光闌。（2）相差物鏡（鏡頭上標(biāo)有PC或PH字樣）物鏡的后焦平面上裝有相板，這是相差顯微鏡的重要裝置。相板上和環(huán)狀光闌相對(duì)應(yīng)的環(huán)狀部分大多數(shù)是涂的吸取膜和推遲相位膜，其它部分完全透明。從標(biāo)本上射過(guò)來(lái)的光線，繞射光部分穿過(guò)透明區(qū)；直射光則穿過(guò)相板的環(huán)狀部分，光強(qiáng)度削弱，相位也適宜變化。普通所用的相板推遲相位1/4，吸取80％的直射光，這樣，就使直射光和繞射光的強(qiáng)度靠近，而相位差則增大或減少。由于透明標(biāo)本內(nèi)部構(gòu)造的折射率不同，產(chǎn)生繞射光的相位就會(huì)有不同程度的推遲，繞射光和直射光的干涉作用將相位差變成振幅差。（3）綠色濾光片為了獲得良好的相差，最佳用單色光線照明，普通選用綠色光線。（4）合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡為使環(huán)狀光闌的中心與物鏡的光軸完全在始終線上，必須拔出目鏡，裝上特別的低倍望遠(yuǎn)鏡（圖Ⅲ-10，B），使相板的暗環(huán)與環(huán)狀光闌的明環(huán)合軸（圖Ⅲ-11）。微生物實(shí)驗(yàn)室慣用消毒滅菌辦法消毒（disinfection）與滅菌（sterilization）兩者的意義有所不同。消毒普通是指消亡病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體而言，滅菌則是指殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子。消毒與滅菌的辦法諸多，普通可分為加熱、過(guò)濾、照射和使用化學(xué)藥品等辦法。一、加熱法又分干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。1．干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種?；鹧鏌茰缇嫌糜诮臃N環(huán)、接種針和金屬用品如鑷子等，無(wú)菌操作時(shí)的試管口和瓶口也在火焰上作短暫燒灼滅菌。普通所說(shuō)的干熱滅菌是在電烘箱內(nèi)滅菌，此法合用于玻璃器皿如吸管和培養(yǎng)皿等的滅菌，在熱空氣160—170℃下保溫2小時(shí)進(jìn)行滅菌。2．濕熱滅菌（1）高壓蒸汽滅菌法此法是將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)1．05kg/cm2（15磅/英寸2），121．3℃保持15—30分鐘進(jìn)行滅菌。時(shí)間的長(zhǎng)短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化，以