電針百會(huì)、風(fēng)府和陽陵泉對(duì)帕金森病模型大鼠的治療作用及機(jī)理研究

電針百會(huì)、風(fēng)府和陽陵泉對(duì)帕金森病模型大鼠的治療作用及機(jī)理研究

帕金森病（parkinson’sdisease，pd）也被稱為痙攣性麻麻痹性疾病，是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上主要表現(xiàn)為沉默振動(dòng)和運(yùn)動(dòng)遲緩。還有語言減少、聲音低沉、單調(diào)、吞咽困難、流涎、睡眠障礙、抑郁和癱瘓等癥狀，嚴(yán)重影響了患者的運(yùn)動(dòng)能力和生活質(zhì)量。由于PD的病因尚未完全明確,于是提出各種假說,如遺傳因素學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、環(huán)境因素學(xué)說、細(xì)胞凋亡學(xué)說等。而氧化應(yīng)激學(xué)說在PD的發(fā)病中仍占主導(dǎo)地位。此外,由于PD是一種慢性進(jìn)展性疾病,目前尚無根治的方法,治療以左旋多巴等藥物為主,但只能緩解臨床癥狀,且療效遞減性以及副作用(抑郁、焦慮、幻覺、欣快、精神錯(cuò)亂、輕度躁狂等)一直是困擾人們的難題。近年來,針灸以其自身優(yōu)勢,在改善PD的運(yùn)動(dòng)障礙、延緩PD進(jìn)程、減少左旋多巴的毒副作用、提高患者的生活質(zhì)量等方面已發(fā)揮了重要作用,逐漸受到人們的重視,針灸因此成為治療帕金森病的方法之一。本研究通過觀察電針“百會(huì)”、“風(fēng)府”和“陽陵泉”對(duì)帕金森病模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,探討電針對(duì)帕金森病可能的作用機(jī)制。1材料和方法1.1動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠60只,體重180~220g,由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào):SYXK(滬)2004-2005。1.2藥物、試劑與儀器藥物及試劑:美多芭(上海羅氏制藥公司,批號(hào)SH11687),6-羥基多巴胺(美國Sigma公司,批號(hào)048k3728)、阿撲嗎啡(美國Sigma公司,批號(hào)100839-200601)、抗壞血酸(美國Sigma公司,批號(hào)063k1082),慶大霉素(上海第一制藥廠),丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所),戊巴比妥鈉(上海中西藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)WS20090920),冰醋酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),等。儀器:TOW-3A型大鼠腦立體定位儀(廣東汕頭市教育醫(yī)學(xué)儀器廠),XW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠),UV754N型紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司),華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠),KWD-808型全能脈沖電療儀(上海電子儀器廠)等。1.3骨髓細(xì)胞注射治療采用經(jīng)典的PD模型。術(shù)前按常規(guī)進(jìn)行行為測試,確認(rèn)無異常旋轉(zhuǎn)行為后,用戊巴比妥鈉(3%的戊巴比妥鈉,50mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上,頭部去毛,苯扎溴銨常規(guī)消毒。無菌條件下,沿正中線切開大鼠顱頂皮膚,剝離骨膜,暴露前囟。以前囟為準(zhǔn),根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜,確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標(biāo):①前囟后5.2mm,正中線右側(cè)1.0mm,硬膜下9.0mm。②前囟后5.2mm,正中線右側(cè)2.5mm,硬膜下8.5mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開顱骨,用5μL微量進(jìn)樣器將6-OHDA(溶于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中,即秤量藥品抗壞血酸0.001g,溶于生理鹽水0.5mL中)注入右側(cè)黑質(zhì)部(以1.0mm/min速度緩慢進(jìn)針),每孔3μL,注射速度為1μL/min,注射完畢后留針5min,然后以1.0mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后,用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合切口皮膚,肌肉注射慶大霉素7d,待動(dòng)物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。正常對(duì)照組只固定大鼠,不進(jìn)行任何處理。10d后,以腹腔注射APO0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn),記錄從開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均>7次/min者為合格的PD模型。1.4模型組和方法將成功PD模型大鼠(31只)隨機(jī)分為4組:①電針組9只:采用類比法取穴,腧穴定位如下:風(fēng)府:在大鼠頭項(xiàng)部,枕外隆凸直下凹陷處;百會(huì):在大鼠頭頂部,兩耳尖連線的中點(diǎn)處;陽陵泉:在大鼠小腿外側(cè),膝關(guān)節(jié)下外1.5cm處。用0.25×13mm的針灸針,刺0.6~1cm深,稍行提插捻轉(zhuǎn)手法。使用全能脈沖電療儀,正、負(fù)電極輸出線分別夾在“百會(huì)”、“風(fēng)府”和雙側(cè)“陽陵泉”穴位上的毫針針柄上。選用斷續(xù)波型,電針頻率為5hz,電流強(qiáng)度為20mA左右,以肌肉出現(xiàn)輕微抽動(dòng)為準(zhǔn)。每次刺激時(shí)間為15min,每日1次,每周6次,共治療4周。②美多芭組8只:灌胃給藥,劑量135mg/kg(10mL/kg),每日1次,每周6次,共給藥4周。③電針結(jié)合美多芭組8只:方法如電針組治療結(jié)合美多芭組治療,每日1次,每周6次,共治療4周。④模型組6只:不做任何處理。正常對(duì)照組6只也不做任何處理。各組除干預(yù)措施不同外,其余各條件一律相同。1.5腦黑質(zhì)塊的勻漿治療結(jié)束后,立即斷頭取腦,小心分離黑質(zhì),制備腦黑質(zhì)勻漿液。操作方法:取腦黑質(zhì),在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,放入10mL的勻漿管內(nèi);在勻漿管中加冷的0.86%鹽水0.65mL,用眼科剪盡快剪碎腦黑質(zhì)塊;再加入冷的0.86%生理鹽水0.3mL進(jìn)行充分勻漿。將勻漿液以4000r/min離心15min,將上清液置-20℃冰箱中備用。1.6mda,gsh,gsh-px和sod的檢測氧自由基檢測方法:取適量上清液進(jìn)行MDA,GSH,GSH-Px和SOD的檢測,具體方法按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進(jìn)行測試。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(mean±s)表示,兩組間各參數(shù)比較采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,t檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,其中P<0.05說明兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01說明兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2各組大鼠sod、gsh-px活性的比較動(dòng)物造模成功率57.41%.與正常對(duì)照組比較,模型組SOD活性降低,MDA含量升高,GSH含量降低,GSH-PX活性降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,電針組、美多芭組、電針+美多芭組均能提高SOD、GSH-Px活性,提高GSH含量和降低MDA含量,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而美多芭組,電針組和電針+美多芭組黑質(zhì)中SOD、MDA、GSH和GSH-Px含量測定結(jié)果比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見表1)3陽陵泉穴及其及其三穴治療對(duì)帕金森病模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響《資生經(jīng)》曰:“百會(huì)”又名天滿,屬督脈,為督脈與足太陽、手足少陽和足厥陰五條經(jīng)脈之所會(huì),故有“三陽五會(huì)”之稱,《針灸大成》中稱“主心煩悶,驚悸健忘,忘前失后,心神恍惚”,具開竅醒神之功,針刺“百會(huì)”可以激發(fā)頭部和諸經(jīng)經(jīng)氣,治療腦病和十四經(jīng)病,調(diào)一身之陰陽氣血,補(bǔ)腦益髓。風(fēng)府穴出自《素問》,“頭重,身痛,惡寒,治在風(fēng)府”,《備急千金要方》風(fēng)府主治“舌緩,不能言”,這些臨床癥狀似屬于帕金森病癥狀范疇;針刺風(fēng)府穴可以振奮督脈陽氣,宣散風(fēng)邪,調(diào)理氣血,使經(jīng)脈氣血疏通,臨床帕金森病治療有較多應(yīng)用。陽陵泉穴始出自《靈樞·邪氣臟腑病形》篇,是足少陽膽經(jīng)合穴,又是八會(huì)穴之一的“筋會(huì)”,位于小腿外側(cè)當(dāng)腓骨頭前下方凹陷處,是臨床的常用穴;具有強(qiáng)健腰膝、通絡(luò)止痛等功效;近年來,陽陵泉穴單穴或處方配穴應(yīng)用治療多種疾病,如肩周炎、膝關(guān)節(jié)炎、面肌痙攣、偏癱、坐骨神經(jīng)痛、扭挫傷等病證;臨床研究認(rèn)為針刺陽陵泉,對(duì)調(diào)整腦血流量有一定影響,對(duì)急性缺血性中風(fēng)患者,通過針刺治療取得良好療效?；谏鲜鲈蚣捌渑R床在治療帕金森病的應(yīng)用,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)性的選擇“百會(huì)”、“風(fēng)府”和“陽陵泉”三穴,并考察電針該三穴位對(duì)帕金森病模型大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響,探討電針對(duì)帕金森病可能的作用機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組與正常對(duì)照組比較,SOD活性降低,MDA含量升高,GSH含量降低,GSH-PX活性降低,提示帕金森病大鼠的氧化反應(yīng)被激活,處于氧化應(yīng)激狀態(tài);同時(shí)說明機(jī)體清除氧自由基的能力低,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損,機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度加重。與模型組比較,美多芭組、電針組、電針結(jié)合美多芭組均能提高SOD活性,提高GSH-Px活性,提高GSH含量和降低MDA含量,說明三種治療方法均能使機(jī)體清除氧自由基的能力提高,機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度減輕,對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)