基于hplc指紋圖譜的半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的藥效研究

基于hplc指紋圖譜的半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的藥效研究

半夏天南星科植物（pr）是半夏屬植物的干燥區(qū)域，主要產(chǎn)于四川、山東、河南、陜西、云南、貴州等省。半夏為中醫(yī)臨床常用中藥,其性辛、溫,具有燥濕化痰、消痞散結(jié)之功。因其味辛辣、麻舌刺喉,具有“戟人咽”的刺激性,故生半夏一般不內(nèi)服,臨床炮制后應(yīng)用。姜半夏PinelliaeRhizomaPraeparatumcumZingibereetAlumine(PRPZA)為《中國藥典》2010年版收載的半夏炮制品,由生姜煎湯,加白礬與半夏共煮而成,具有溫中化痰、降逆止嘔的功效,多用于痰飲嘔吐等。半夏成分復(fù)雜,主要含核苷類、生物堿、有機(jī)酸、蛋白、氨基酸、多糖、揮發(fā)油等,目前報(bào)道的與半夏藥效、質(zhì)量相關(guān)的成分主要有核苷類、生物堿類和有機(jī)酸類。半夏經(jīng)姜制成姜半夏,增加了止嘔的功效,與炮制過程中加入生姜有關(guān),生姜具有降逆止嘔功效,其主要藥效成分為6-姜辣素。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC梯度洗脫法首次建立了半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜,并對肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿、6-姜辣素6個特征性成分進(jìn)行指認(rèn),為半夏炮制前后主要物質(zhì)基礎(chǔ)的改變以及二者的質(zhì)量控制提供可靠方法和科學(xué)依據(jù)。1藥品、試劑與儀器KQ—500DB數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Agilenttechnologies1200高效液相色譜儀;Heidolph-Laborota4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道夫公司);AllegraX—22R離心機(jī)(美國貝克曼公司);BP121S十萬分之一電子天平(德國賽多利斯公司)。對照品鳥苷(批號86-09-10,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%)、肌苷(批號140669-200401,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)、腺苷(批號110879-200202,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%)、琥珀酸(批號110896-200202,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)、鹽酸麻黃堿(批號0714-9903,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)、6-姜辣素(批號111610-201106,質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.6%),中國食品藥品檢定研究院;乙腈為色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。生半夏藥材采自全國5個省份;姜半夏飲片8批,其中按《中國藥典》2010年版方法,用生半夏炮制3批,見表1。樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Berit.的干燥塊莖及其炮制品姜半夏。2方法和結(jié)果2.1姜半夏的制備按照《中國藥典》2010年版姜半夏炮制方法進(jìn)行炮制。2.2%乙腈基苯磺酸酯3.2%AgilentEclipseXDBC18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈-水為流動相進(jìn)行梯度洗脫,洗脫程序:0~10min,0.5%~1.0%乙腈;10~15min,1.0%~1.5%乙腈;15~30min,1.5%~5.5%乙腈;30~35min,5.5%~10.0%乙腈;35~45min,10.0%~15.0%乙腈;45~50min,15.0%~20.0%乙腈;50~57min,20.0%~26.0%乙腈;57~62min,26.0%~33.0%乙腈;62~63min,33.0%~37.0%乙腈;63~77min,37.0%~50.0%乙腈;77~87min,50.0%乙腈;87~92min,50.0%~0.5%乙腈;體積流量1.0mL/min;檢測波長265nm;柱溫30℃;進(jìn)樣量10μL。2.3對照品溶液的配制核苷對照品溶液的制備:精密稱取鳥苷、肌苷、腺苷對照品各2mg,分別置于10mL量瓶中,加水定容,搖勻,配成0.2mg/mL對照品溶液。琥珀酸、鹽酸麻黃堿、6-姜辣素對照品溶液的制備:精密稱取3種對照品各2mg,置于10mL量瓶中,加甲醇定容,搖勻,配成0.2mg/mL對照品溶液。2.4乙醇法提取添加0.4%的微孔濾膜水提液:分別精密稱取半夏、姜半夏粉末(過60目篩)各0.5g,加水5mL,超聲提取45min,放冷后補(bǔ)足減失的質(zhì)量,離心,取上清液,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,即得。75%乙醇提取液:分別精密稱取半夏、姜半夏粉末(過60目篩)各0.5g,加75%乙醇5mL,超聲提取45min,放冷后補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過,回收乙醇,用甲醇定容至5mL,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,即得。95%乙醇提取液:分別精密稱取半夏、姜半夏粉末(過60目篩)各0.5g,加95%乙醇5mL,超聲提取45min,放冷后補(bǔ)足減失的質(zhì)量,濾過,回收乙醇,用甲醇定容至5mL,經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過,即得。2.5儀器精密度試驗(yàn)2.5.1空白試驗(yàn)精密吸取甲醇溶液10μL作為空白溶液,注入高效液相色譜儀,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。結(jié)果表明,空白溶液對測定結(jié)果無干擾。2.5.2測定時間的確定精密吸取半夏、姜半夏供試品溶液各10μL,注入高效液相色譜儀,按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,87min后,繼續(xù)保持50%乙腈洗脫30min,色譜圖顯示,保留時間92min后無色譜峰,故將時間確定為92min。2.5.3精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,檢測指紋圖譜,結(jié)果表明各共有峰相對保留時間的RSD在0.09%~1.20%,相對峰面積的RSD在0.72%~1.80%,說明儀器精密度良好。2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液10μL,分別在0、3、6、9、12、24h進(jìn)樣,檢測指紋圖譜,結(jié)果表明各色譜峰相對保留時間的RSD在0.08%~0.58%,相對峰面積的RSD在0.64%~2.80%,符合指紋圖譜要求,表明供試品溶液在24h內(nèi)較穩(wěn)定。2.6巖肉樣品水部位相似度檢測2.6.1半夏藥材HPLC特征指紋圖譜的建立將收集的半夏藥材按供試品溶液的制備方法進(jìn)行制備,精密吸取供試品溶液各10μL注入高效液相色譜儀,進(jìn)行測定,記錄92min的色譜圖,梯度平衡10min。由色譜圖可知,鳥苷的色譜峰分離良好,峰形穩(wěn)定,且各樣品中均含有此峰,故將保留時間為16.937min的色譜峰(鳥苷)作為參照峰。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”,對半夏藥材不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜進(jìn)行考察,水及75%、95%乙醇提取部位的指紋圖譜共有峰分別為12、13、16個,其中指認(rèn)了5個特征峰,分別為肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿,見圖1~4。與水部位相比,75%乙醇提取部位新增1個峰,為圖3中的12號峰(26.4min);95%乙醇提取部位較水、75%乙醇提取部位,色譜峰增多,說明隨著提取溶劑極性的降低,溶出的化學(xué)成分也隨之增加。2.6.2半夏藥材HPLC特征指紋圖譜相似度分析采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版”,以半夏藥材不同提取部位的共有模式圖為參照,計(jì)算相似度,結(jié)果編號bx-1、bx-2、bx-3、bx-4、bx-5、bx-6、bx-7、bx-8、bx-9、bx-10樣品水部位相似度分別為0.996、0.985、0.976、0.909、0.917、0.959、0.992、0.993、0.967、0.956;75%乙醇提取部位相似度分別為0.989、0.967、0.992、0.943、0.965、0.979、0.903、0.923、0.987、0.971;95%乙醇提取部位相似度分別為0.993、0.977、0.977、0.990、0.916、0.945、0.944、0.936、0.959、0.987。半夏藥材不同提取部位(水及75%、95%乙醇提取部位)具有較高的相似度,其值均在0.9以上,但化學(xué)成分的量存在一定差異;通過比較半夏水及75%、95%乙醇提取部位的HPLC指紋圖譜共有模式發(fā)現(xiàn),三者色譜峰數(shù)目及保留時間差異不大,見圖2~4。2.6.3姜半夏飲片HPLC特征指紋圖譜的建立姜半夏飲片特征指紋圖譜的測定方法同“2.6.1”項(xiàng),姜半夏水部位、75%乙醇提取部位的共有峰為12個;95%乙醇提取部位的共有峰為11個,與水、75%乙醇提取部位相比,缺失1個共有峰,為圖5、6中的13號峰(27.9min)。其中指認(rèn)了6個特征峰,分別為肌苷、鳥苷、腺苷、琥珀酸、鹽酸麻黃堿、6-姜辣素,見圖5~7。2.6.4姜半夏HPLC特征指紋圖譜相似度分析按照“2.6.2”方法計(jì)算相似度,結(jié)果編號jbx-1、jbx-2、jbx-3、jbx-4、jbx-5、jbx-6、jbx-7、jbx-8樣品水部位相似度分別為0.954、0.921、0.919、0.937、0.992、0.906、0.928、0.917;75%乙醇提取部位相似度分別為0.996、0.983、0.943、0.942、0.982、0.994、0.994、0.969;95%乙醇提取部位相似度分別為0.991、0.982、0.967、0.962、0.959、0.977、0.986、0.990。結(jié)合圖5~7可看出,各不同提取部位的姜半夏飲片HPLC指紋圖譜相似度較高,且共有峰相對保留時間的RSD均在3.0%以下,僅色譜峰峰面積有所變化。2.6.5半夏藥材與炮制品姜半夏HPLC特征指紋圖譜比較本實(shí)驗(yàn)對半夏及其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜進(jìn)行了比較,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者指紋圖譜中色譜峰的數(shù)目與峰面積不同,且圖譜間差異大,相似度低,僅為0.219~0.774,結(jié)果見表2。從兩者的水部位(圖2、5)中可看出,炮制品姜半夏與生半夏相比,新增2個峰,分別為圖5中的10號峰(18.3min)、19號峰(6-姜辣素,73.5min);缺失2個峰,分別為圖2中的11號峰(23.8min)、14號峰(33.9min)。在75%乙醇提取部位(圖3、6)指紋圖譜中,姜半夏與半夏相比,新增2個峰,分別為圖6中的10號峰(18.3min)、19號峰(6-姜辣素,73.5min);缺失3個峰,分別為圖3中的11號峰(23.8min)、12號峰(26.4min)、14號峰(33.9min)。在95%乙醇提取部位指紋圖譜(圖4、7)中,姜半夏與半夏相比,新增2個峰,為圖7中的10號峰(18.3min)、19號峰(6-姜辣素,73.5min);缺失7個峰,分別為圖4中的6號峰(14.1min)、7號峰(15.3min)、11號峰(23.8min)、12號峰(26.4min)、13號峰(腺苷,27.9min)、17號峰(52.8min)和18號峰(66.8min)。半夏與其炮制品姜半夏不同提取部位的HPLC特征指紋圖譜除色譜峰數(shù)目不同外,峰面積也不同,整體隨著提取溶劑極性的降低而減少,95%乙醇提取部位下降最為顯著,這充分說明半夏姜制后,化學(xué)成分在質(zhì)和量上發(fā)生了明顯的變化。2.6.6主成分分析(PCA)對半夏、姜半夏不同溶劑提取部位的HPLC特征指紋圖譜保留時間(tR)以及與tR對應(yīng)的相關(guān)峰面積進(jìn)行PCA,結(jié)果見表3。前4個主成分的累積貢獻(xiàn)率為79.95%,主成分1為36.6%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:9.1、11.8、20.0、23.1min以及tR為7.7、9.1、23.1min的相關(guān)峰面積;主成分2為23.78%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:11.0、18.3、23.5、33.4、73.6min以及tR為5.5、6.3、7.7、18.3min的相關(guān)峰面積;主成分3為11.32%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:23.5、33.4、52.7min以及tR為20.0、23.5、52.7min的相關(guān)峰面積;主成分4為8.25%,其特征向量載荷較高同時符號為正的tR有:6.3、7.7、17.0min以及tR為6.3、33.4min的相關(guān)峰面積。根據(jù)半夏及其姜半夏不同提取部位HPLC指紋圖譜的tR以及與tR對應(yīng)的相關(guān)峰面積得到PCA二維載荷圖和3D得分圖,見圖8、9。從圖中可以看出,PCA能夠很好地將不同類別樣品區(qū)分開來。3討論3.1指紋圖譜的建立本實(shí)驗(yàn)對提取溶劑、色譜柱、流動相和檢測波長進(jìn)行了考察,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),相同色譜條件下,不同提取溶劑:水,75%、95%乙醇,甲醇和醋酸乙酯,以水及75%、95%乙醇為提取溶劑得到的色譜峰數(shù)目較多,且分離度良好;AgilentEclipseXDBC18分離度優(yōu)于WaterssymmetryC18;分別對乙腈-水、乙腈-0.02%磷酸水溶液和甲醇-水3種流動相系統(tǒng)進(jìn)行了考察,結(jié)果表明乙腈-水的指紋圖譜色譜峰較多且分離效果較好;通過比較8個波長下的HPLC特征指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)在265nm下色譜峰數(shù)目多,且強(qiáng)度及分離度好。在本實(shí)驗(yàn)建立的色譜條件下,半夏及姜半夏不同提取部位中的化學(xué)成分分離度良好,圖譜清晰,方法重復(fù)性好、精密度高,可系統(tǒng)、有效地控制半夏藥材及姜半夏飲片的質(zhì)量。3.2姜夏峰分離度的