煙草對(duì)氧化脅迫的耐受性分析

生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)張鵬ComprehensiveAnalysisofGeneExpressionin

NicotianatabacumLeavesAcclimatedto

OxidativeStress氧化脅迫耐受性煙草葉片中基因表達(dá)的綜合分析PNASAugust6,2002vol.99no.1610871文獻(xiàn)摘要引言材料與方法結(jié)果討論目錄由植物適應(yīng)氧化應(yīng)激(脅迫)的分子機(jī)制了解甚少。為了鑒定該適應(yīng)的過程，我們對(duì)煙草葉片適應(yīng)氧化應(yīng)激進(jìn)行了基因表達(dá)的綜合分析。結(jié)合mRNA差異顯示和cDNA陣列分析，我們估計(jì)至少有95個(gè)基因在煙葉適應(yīng)氧化應(yīng)激過程中它們的表達(dá)會(huì)改變，其中83％被誘發(fā)，17％被抑制。53個(gè)序列標(biāo)簽序列分析表明，除了抗氧化基因，與生物和非生物脅迫的防御、細(xì)胞保護(hù)和解毒、能量和碳水化合物的代謝、新蛋白的合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的基因表達(dá)也被改變。大部分基因的表達(dá)增強(qiáng)，但是除了與光合作用和光調(diào)節(jié)過程相關(guān)的基因被抑制了。摘要在植物適應(yīng)氧化脅迫過程中，觀察到共調(diào)節(jié)基因的兩個(gè)不同的群體（“早期”

和“晚期響應(yīng)”基因調(diào)節(jié)子），這表明至少有兩個(gè)不同的基因誘導(dǎo)途徑的存在。這兩個(gè)基因調(diào)節(jié)子對(duì)氧化應(yīng)激也表現(xiàn)出的兩種不同的表達(dá)模式。在適應(yīng)脅迫的葉片部位“后期響應(yīng)”基因表達(dá)增強(qiáng)，而“早期反應(yīng)”基因的表達(dá)則不是?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)是與廣泛的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)的一個(gè)非常復(fù)雜的過程。此外，我們的數(shù)據(jù)表明，除了防衛(wèi)基因誘導(dǎo)，植物過敏加強(qiáng)了基因表達(dá)可能是適應(yīng)氧化應(yīng)激的一個(gè)重要因素。植物處于非致死的生物或非生物脅迫時(shí)，通常會(huì)呈現(xiàn)對(duì)一般的，劑量相同的致死因子的耐受性，而這種現(xiàn)象被稱為馴化（適應(yīng)）或獲得抗病性。這種誘導(dǎo)產(chǎn)生的脅迫抗性并不限于同一類型的脅迫，也有關(guān)于不同的應(yīng)激之間的交叉耐受性的相關(guān)報(bào)道。由于許多脅迫條件導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原失衡，有研究表明植物對(duì)氧化應(yīng)激的防御有助于誘導(dǎo)對(duì)非生物和生物脅迫的耐受性，而且是交叉耐受性介導(dǎo)的關(guān)鍵成分。有個(gè)現(xiàn)象也說明這個(gè)概念，即適應(yīng)熱或冷的植物會(huì)呈現(xiàn)對(duì)病原體的抗性并對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)生更高的耐受性。引言抗氧化防御反應(yīng)主要是增強(qiáng)抗氧化酶活性和增加抗氧化代謝物的水平，如抗壞血酸，谷胱甘肽，α-生育酚和類胡蘿卜素。最近更多研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)小熱激蛋白，細(xì)胞保護(hù)基因谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）和發(fā)病機(jī)理相關(guān)基因PR2都與對(duì)氧化脅迫的耐性相關(guān)。對(duì)各種氧化劑的適應(yīng)反應(yīng)已在細(xì)菌和酵母中被廣泛研究。在細(xì)菌中，通過亞致死劑量的氧化應(yīng)激產(chǎn)生了至少80種蛋白，并觸發(fā)對(duì)致死的氧化脅迫的耐受性，而酵母中至少有900個(gè)基因的表達(dá)受到影響。為了解更多氧化應(yīng)激使植物獲得抗性的分子機(jī)制，我們用mRNA差異顯示分析煙草葉片對(duì)氧化應(yīng)激的基因表達(dá)的變化。本研究顯示了該過程的高度復(fù)雜性，并揭示了其基因和機(jī)制，為氧化脅迫耐性的研究做出貢獻(xiàn)。1、植物材料、培養(yǎng)條件和甲基紫精(MV)MethylViologen處理

在100μmolm-2s-1的光子通量下，16小時(shí)的光照和8小時(shí)的黑暗，70%的相對(duì)濕度，恒溫24°C的條件下生長5周，不同的植物中切出3個(gè)直徑1cm的圓孔，近軸端施用12ml的甲基紫精溶液，對(duì)照組使用超純水。使用電導(dǎo)儀測(cè)定葉盤離子滲漏溶液的導(dǎo)電性。2、RNA提取和RNA凝膠印記分析3、差異顯示4、DNA序列分析材料和方法1、煙草對(duì)甲基紫精的敏感性為了鑒定植物中基因?qū)m應(yīng)氧化脅迫的差異表達(dá)，使用MV。雖然低濃度的AOS誘導(dǎo)防御反應(yīng)，但高濃度的AOS導(dǎo)致細(xì)胞死亡。為了避免細(xì)胞惡化基因的表達(dá)，我們首先確定亞致死MV的濃度。為此，煙草葉盤上用不同濃度的MV，并監(jiān)測(cè)溶質(zhì)的電導(dǎo)率。結(jié)果相比用水處理過的葉盤，0.2μM和較低濃度的MV只造成較小的離子滲漏，即使經(jīng)過42小時(shí)的培養(yǎng)也并沒有觀察到明顯的損傷，（圖1）。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，上述濃度的MV用于誘導(dǎo)對(duì)氧化應(yīng)激的耐受性。大于0.2μM的濃度導(dǎo)致了大量的離子滲漏和細(xì)胞死亡（圖1），并用于評(píng)估植物對(duì)氧化脅迫的耐受性。2、亞致死劑量的MV處理使得煙草葉片對(duì)致死劑量的MV誘導(dǎo)的氧化脅迫產(chǎn)生適應(yīng)性。使用0.2μMMV或更低濃度（預(yù)處理）各種時(shí)期的煙草葉盤隨后轉(zhuǎn)移到含有致命劑量的MV溶液中做耐受性評(píng)估（處理）。當(dāng)葉盤用0.1μMMV進(jìn)行預(yù)處理17小時(shí)（含8小時(shí)黑暗期）并在一個(gè)11小時(shí)的處理后進(jìn)行抗逆性評(píng)估，煙葉對(duì)MV的抗性非常顯著（與水處理的對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組溶質(zhì)電導(dǎo)率減少了40％）（圖2A）。為了測(cè)試這種對(duì)MV的耐性究竟不僅僅只是一種生理反應(yīng)，還涉及核基因表達(dá)的改變，通過Northern雜交檢測(cè)mRNA水平的抗氧化基因GPX和SodCc被檢測(cè)。0.1μMMV預(yù)處理的葉片中這兩種抗氧化基因都被誘導(dǎo)，并且在整個(gè)氧化應(yīng)激的適應(yīng)期樣品中它們的的表達(dá)增強(qiáng)了（圖2B）。這一觀察結(jié)果表明，煙葉對(duì)MV強(qiáng)加的氧化脅迫不僅是一種生理反應(yīng)，還涉及核基因表達(dá)的改變，說明GPX和SodCc起到增強(qiáng)耐受性的作用。3、對(duì)耐藥性的煙葉做全基因組表達(dá)分析。

為了闡明氧化脅迫耐受性增強(qiáng)的的分子過程，進(jìn)行了全基因組表達(dá)分析。通過mRNA差異顯示技術(shù)對(duì)無論是水或0.1μMMV預(yù)處理17小時(shí)的煙草葉盤進(jìn)行了對(duì)比。用80個(gè)引物組合，耐受性和無耐受性的樣品中始終差異表達(dá)的大于150bp的243個(gè)帶（表1）被鑒定出來。對(duì)146個(gè)帶的序列分析表明，50％的頻帶是含有兩個(gè)或更多不同的cDNA片段的混合體。因此，源于這146個(gè)帶的單一序列被重新擴(kuò)增，擺著尼龍膜上，并與來自耐受性和無耐受性的煙草葉盤中的cDNA探針雜交。

對(duì)13個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)的基因進(jìn)行了測(cè)試，并通過RNA凝膠印跡分析來重新確認(rèn)，驗(yàn)證cDNA微陣列分析的結(jié)果。4、氧化應(yīng)激處理過程中誘導(dǎo)基因的差異表達(dá)

對(duì)0.1μMMV預(yù)處理（馴化）和隨后的1μMMV處理過程中的11個(gè)選擇的基因的表達(dá)進(jìn)行了分析（氧化應(yīng)激，圖3）。在預(yù)處理的第一個(gè)4小時(shí)，除了多功能蛋白（MFP）和脂氧合酶2（LOX2）的基因密碼被誘導(dǎo)外，水和MV預(yù)處理的樣品中并沒有明顯的誘導(dǎo)基因表達(dá)，可能是葉盤正在適應(yīng)的結(jié)果。經(jīng)過12小時(shí)后，暴露在0.1μMMV中的樣本所有的基因被誘導(dǎo)。然而，在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，感應(yīng)還是相當(dāng)?shù)?，可能反映了?小時(shí)的黑暗期（無光合活性）需要由MV積累最大量的超氧化物。最后5小時(shí)在光照下的預(yù)處理過程增強(qiáng)了mRNA的誘導(dǎo)。

在隨后的1μMMV處理，無耐性的樣品中的所有基因被誘導(dǎo)并且產(chǎn)生耐性的樣品中（forLox2除外）的基因被進(jìn)一步誘導(dǎo)。一組基因（EAS，TPK，LOX2，和MFP）被1μMMV迅速誘導(dǎo)（3和6小時(shí)之間達(dá)到峰值），并且這兩個(gè)未處理和預(yù)處理過的樣品在相同的水平（圖3）。在基因的第二組（PRB-1b中，CBP20，VSMDR，DNAJ，和WRKY11），感應(yīng)是相當(dāng)緩慢的，無耐受性的樣品在6和9小時(shí)之間達(dá)到最大表達(dá)水平，適應(yīng)的樣品中是3和6小時(shí)?；虻牡诙M中適應(yīng)的樣品表達(dá)明顯要高，1μMMV處理后至少6小時(shí)，也不像非適應(yīng)樣本中的那么高。測(cè)試的所有基因的轉(zhuǎn)錄水平在處理結(jié)束后下降。在抗氧化基因GPX和SodCc中觀察到類似的表達(dá)模式（圖2）。5、通過聚類分析確定基因共表達(dá)的兩個(gè)主要調(diào)控子。

通過MV氧化應(yīng)激處理過程中挑選出來的基因的差異表達(dá)表明，可能是由不同途徑來激活基因。為了探討這種可能性，在0.1MMV預(yù)處理過程中進(jìn)行更詳細(xì)的基因表達(dá)分析。

基于基因表達(dá)譜，兩個(gè)共調(diào)節(jié)基因（調(diào)控子）的大型集群被鑒定出來（圖4）。一個(gè)集群（圖4A）含有的基因它們的表達(dá)在預(yù)處理15小時(shí)結(jié)束前達(dá)到高峰，然后下降（早期反應(yīng)基因）。第二個(gè)簇（集群）（圖4B）的基因的表達(dá)仍然很高，持續(xù)到預(yù)處理結(jié)束時(shí)（晚期反應(yīng)基因）。有趣的是，在氧化應(yīng)激處理過程中耐受性葉盤表達(dá)增大的基因（PRB-1b中，CBP20，VSMDR，DNAJ，WRKY11，谷胱甘肽過氧化物，和ATPCL）都屬于晚期反應(yīng)基因簇，而其他（EAS，TPK，LOX2和MFP）是早期反應(yīng)基因簇的一部分?；虻木垲惐砻鳎鼈冇上嗤男盘?hào)通路調(diào)節(jié)類似的細(xì)胞過程中的功能。因此，耐受性煙草葉盤中被誘導(dǎo)的基因的表達(dá)可能通過一個(gè)MV-依賴的方式來調(diào)節(jié)包括至少兩種不同的的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且兩組共調(diào)節(jié)基因可能在氧化應(yīng)激的適應(yīng)中扮演特異的角色。為了表述植物中與氧化脅迫耐性相關(guān)的分子反應(yīng)特征，我們對(duì)適應(yīng)氧化應(yīng)激的煙草葉盤進(jìn)行全基因組基因表達(dá)分析。當(dāng)我們用