馬鈴薯葉片耐鹽突變體篩選

馬鈴薯葉片耐鹽突變體篩選

土壤中的養(yǎng)分過多會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生損害，稱為鹽害。當(dāng)前對(duì)于鹽漬土的開發(fā)利用主要采取兩種措施:一是通過工程來改良鹽堿土壤;二是生物治理,即通過農(nóng)業(yè)生物技術(shù)培育耐鹽作物品種或開發(fā)利用有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鹽生植物資源以改良土壤。前者雖取得了一定的效果,但因耗資巨大,難以長(zhǎng)久保持,因此人們更寄希望于后者,希望通過生物技術(shù)手段最終達(dá)到改良利用鹽堿地的目的。馬鈴薯對(duì)鹽害較敏感,鹽漬化土壤不利于其生長(zhǎng)。因此,選育耐鹽馬鈴薯品種具有很重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益,尋找一種高效的馬鈴薯抗鹽育種途徑已成為重要的研究課題。雖然馬鈴薯病毒病莖尖組培脫毒技術(shù)的研究基礎(chǔ)比較成熟,馬鈴薯愈傷組織抗病變異株的篩選工作也有研究報(bào)道。但利用馬鈴薯體細(xì)胞無性系變異進(jìn)行耐鹽突變體的篩選,國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究以4個(gè)馬鈴薯栽培品種的葉片為外植體進(jìn)行耐鹽突變體篩選,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法1.1材料表面供試4個(gè)馬鈴薯品種分別為費(fèi)烏瑞它、東農(nóng)303、夏波帝、鄂1號(hào)。1.2培養(yǎng)基的制備葉片愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基:東農(nóng)303、鄂1號(hào)兩品種為MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.2mg/L;費(fèi)烏瑞它為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L;夏波帝為MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L。葉片愈傷不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基:費(fèi)烏瑞它、鄂1號(hào)的最佳分化培養(yǎng)基為MS+6-BA2.5mg/L+GA35.0mg/L;東農(nóng)303為MS+6-BA1.0mg/L+IAA0.1mg/L+GA32.5mg/L;夏波帝為MS+6-BA2.5mg/L+IAA0.5mg/L+GA32.5mg/L。篩選方法采用一步直接篩選法,即將外植體直接培養(yǎng)在含鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。具體方法為:取幼嫩葉片,在含0,2,4,6,8,10,12,14,16g/LNaCl的鹽脅迫培養(yǎng)基中,一次直接誘導(dǎo)產(chǎn)生耐鹽愈傷組織,培養(yǎng)觀察愈傷組織的誘導(dǎo)和生長(zhǎng)情況,將產(chǎn)生的愈傷組織在含相應(yīng)鹽質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。1.3小鹽懸液耐鹽愈傷組織的誘導(dǎo)將經(jīng)6,8,10,12次繼代培養(yǎng)的耐鹽愈傷組織及其對(duì)照分別接種到無鹽和含鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。每處理接種15瓶,每瓶接種4塊愈傷組織。1.4抗鹽突變體的生根和植物再生將通過耐鹽愈傷組織誘導(dǎo)形成的不定芽培養(yǎng)在含鹽與無鹽生根培養(yǎng)基上,進(jìn)行根的誘導(dǎo)。1.5耐鹽突變體的測(cè)定方法1.5.1同鹽質(zhì)量濃度的鹽水灌溉處理選一定大小(植株高10cm左右)的已生根幼苗植株進(jìn)行盆栽,馴化移栽成活后進(jìn)行不同鹽質(zhì)量濃度的鹽水灌溉處理(費(fèi)烏瑞它的耐鹽再生植株澆鹽水濃度為6g/L,東農(nóng)303為8g/L,夏波帝為4g/L,鄂1號(hào)為8g/L)。每周1次,每次澆鹽水50mL,直到對(duì)照植株(未經(jīng)過鹽脅迫篩選的再生植株)死亡,記載耐鹽再生植株的死亡數(shù)。1.5.2耐鹽植物后代的耐鹽性(1)耐鹽突變體的后代對(duì)nacl的等待反應(yīng)將1cm長(zhǎng)的莖尖接種到分別附加0,5,8g/LNaCl培養(yǎng)基上,培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)芽體的生根率、鮮重和干重。每處理重復(fù)30次。(2)愈傷組織的誘導(dǎo)用篩選出的耐鹽突變體的葉片和莖段作外植體,進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)測(cè)定。在附加0,5,8g/LNaCl培養(yǎng)基上培養(yǎng)30d后測(cè)定愈傷組織鮮重與干重。每處理重復(fù)30次。2結(jié)果與分析2.1外植體愈傷組織發(fā)生從表1可以看出,在愈傷誘導(dǎo)過程中,接種在含鹽培養(yǎng)基上的各品種的外植體愈傷生長(zhǎng)量均受到不同程度的抑制,且隨鹽質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。以馬鈴薯鄂1號(hào)品種為例,其受鹽脅迫的動(dòng)態(tài)過程為:將葉片直接接種在含鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng),5d內(nèi)外植體在各鹽質(zhì)量濃度之間無明顯差異。隨后高鹽培養(yǎng)基中的葉片逐漸失綠,并隨鹽質(zhì)量濃度的升高失綠嚴(yán)重。15d后觀察發(fā)現(xiàn),含鹽培養(yǎng)基上的外植體愈傷組織生長(zhǎng)緩慢。對(duì)照中接種的葉片邊緣已卷起,愈傷組織布滿下表面;含鹽培養(yǎng)基中的葉片邊緣微有膨大現(xiàn)象,隨鹽質(zhì)量濃度的增大邊緣膨大減弱。NaCl為14,16g/L時(shí)明顯抑制愈傷組織誘導(dǎo),部分葉片干枯死亡。接種后20d,對(duì)照愈傷量明顯多于其他處理,2,4g/LNaCl脅迫處理抑制程度較輕,外植體表面布滿淡綠色愈傷組織;6g/LNaCl處理部分外植體形成了少量愈傷組織,NaCl達(dá)到8g/L時(shí),葉片膨大的邊緣逐漸黃化,繼續(xù)增加NaCl質(zhì)量濃度,葉片泛黃明顯,膨大邊緣褐化,部分死亡。30d后觀察發(fā)現(xiàn),NaCl為2g/L處理的愈傷組織量與對(duì)照沒有明顯差別,愈傷組織新鮮,有米粒狀突起;4g/LNaCl處理的愈傷組織也有明顯生長(zhǎng),但隨NaCl質(zhì)量濃度的加大,愈傷組織形成量減少,超過12g/L時(shí)外植體黃化干枯。30d的動(dòng)態(tài)觀察表明,外植體在含鹽培養(yǎng)基上培養(yǎng),受抑制程度隨鹽質(zhì)量濃度增加而加劇,適應(yīng)時(shí)間隨鹽質(zhì)量濃度升高而延長(zhǎng)。2.2代樣品的連續(xù)篩選由表2可知,不同品種葉片愈傷組織耐鹽性不同,表現(xiàn)在鹽的最高耐受質(zhì)量濃度不同,相同鹽質(zhì)量濃度下達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)所需的繼代次數(shù)不同。費(fèi)烏瑞它經(jīng)連續(xù)篩選可達(dá)到的最高鹽耐受質(zhì)量濃度為6g/L,其耐4g/LNaCl的變異體選擇培養(yǎng)至第4代已基本穩(wěn)定,愈傷組織的相對(duì)生長(zhǎng)量已接近對(duì)照,篩至第7代時(shí)愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量已超過對(duì)照;耐6g/LNaCl的變異體在第8代時(shí)愈傷相對(duì)生長(zhǎng)量接近對(duì)照,第10代時(shí)相對(duì)生長(zhǎng)量超過了對(duì)照。東農(nóng)303經(jīng)過連續(xù)8代的篩選可以獲得耐受8g/LNaCl的愈傷組織,夏波帝經(jīng)過連續(xù)5代篩選能耐受4g/LNaCl,鄂1號(hào)經(jīng)過連續(xù)篩選8代達(dá)到8g/LNaCl的最高鹽耐受質(zhì)量濃度。相對(duì)生長(zhǎng)量的逐漸提高表明,愈傷組織經(jīng)過多次在含鹽培養(yǎng)基上的繼代可以獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)的耐鹽愈傷組織,并隨繼代培養(yǎng)次數(shù)的增多,對(duì)鹽的耐受質(zhì)量濃度不斷得到提高。2.3種分離菌株的分化率不同繼代次數(shù)的葉片愈傷組織分化率見表3。表3表明,葉片的對(duì)照愈傷組織在含鹽的分化培養(yǎng)基上不能分化,在無鹽培養(yǎng)基中繼代到第10次還有一定程度的分化,費(fèi)烏瑞它的分化率可達(dá)55.4%,繼代次數(shù)增加到12次時(shí),分化率均急劇下降,鄂1號(hào)則失去了分化能力,夏波帝的分化率也降低到3.4%。說明對(duì)照愈傷組織在無鹽培養(yǎng)基中連續(xù)繼代10次以后,愈傷組織的分化能力會(huì)明顯降低。耐鹽愈傷組織在無鹽培養(yǎng)基中繼代10次時(shí),東農(nóng)303的分化率最高為20.3%;繼代12次時(shí)4個(gè)品種均未能分化;在含鹽培養(yǎng)基上,繼代8次的耐鹽愈傷組織的分化率已經(jīng)降到8.5%~11.2%,繼代10次,費(fèi)烏瑞它、東農(nóng)303、鄂1號(hào)已經(jīng)不能分化。2.4無鹽培養(yǎng)基上的耐鹽植物生長(zhǎng)的變化將分化形成的不定芽分別培養(yǎng)在含鹽與無鹽培養(yǎng)基上,由表4的生根情況可以看出,經(jīng)過30d的根誘導(dǎo)培養(yǎng),在無鹽培養(yǎng)基中變異體的生根率與對(duì)照無明顯差異,生根率均在90%以上。但根的質(zhì)量有所不同,突變體形成的根數(shù)量多、粗壯,根短;對(duì)照的根較長(zhǎng),但根的數(shù)量相對(duì)較少。在含鹽培養(yǎng)基上無論對(duì)照還是突變體均未分化形成根,突變體無根苗表現(xiàn)生長(zhǎng)慢,而對(duì)照很快出現(xiàn)枯死現(xiàn)象。因此可以看出,在含鹽培養(yǎng)基中根的分化也受到抑制,這與前面芽的分化受到抑制是一致的。上述得到的耐鹽再生植株在含鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)正常,而且形成小分枝,生長(zhǎng)速度比對(duì)照植株在無鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的略慢,但比對(duì)照植株在含鹽培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)要快得多,植株比較健壯。對(duì)照植株在含鹽培養(yǎng)基上經(jīng)過40d的培養(yǎng)后莖葉明顯發(fā)黃,靠近培養(yǎng)基的部位變黑,平均高度不到2cm,而且形態(tài)不正常。2.5鹽突然變化體的確定2.5.1突變體的存活率對(duì)耐鹽變異株進(jìn)行盆栽澆鹽水試驗(yàn)結(jié)果表明,其耐鹽性明顯高于對(duì)照,在6g/LNaCl脅迫下,費(fèi)烏瑞它與夏波帝的突變體植株和4個(gè)品種的對(duì)照植株全部死亡,東農(nóng)303的突變體植株存活率為45.6%,鄂1號(hào)的存活率為77.3%。2.5.2無鹽培養(yǎng)基上莖尖的生長(zhǎng)情況耐鹽突變體后代莖尖對(duì)NaCl脅迫的反應(yīng)見表5。由表5可以看出,所有耐鹽突變體后代的莖尖對(duì)鹽分脅迫都有一定的適應(yīng)性。在8g/LNaCl脅迫下,耐鹽突變體后代莖尖的生根率在不同品種間存在明顯差異,東農(nóng)303的生根率為33.7%,鄂1號(hào)為44.3%,兩者對(duì)照未見根的發(fā)生,生根率為0。東農(nóng)303在無鹽培養(yǎng)基上莖尖鮮重較對(duì)照生長(zhǎng)得慢,但在5與8g/L的含鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度幾乎是對(duì)照的2倍,鄂1號(hào)也表現(xiàn)出類似的現(xiàn)象。干重的變化趨勢(shì)與鮮重的變化一致。說明所獲得的耐鹽突變株在鹽脅迫下具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。將耐鹽突變體后代葉片、莖段在含鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷誘導(dǎo),并觀察其生長(zhǎng)狀況,結(jié)果(表6)表明,突變體后代的葉片、莖段保留了其對(duì)鹽脅迫的適應(yīng)性,與對(duì)照相比愈傷組織鮮重與干重在5,8g/LNaCl下均有較明顯的生長(zhǎng),愈傷鮮重幾乎是對(duì)照的2倍,特別是變異株在5g/LNaCl水平下葉片與莖段愈傷比空白培養(yǎng)基中鮮重、干重有所增加,而對(duì)照下降幅度較大,因此可以說明篩選出的突變體選擇壓高時(shí),其后代的愈傷組織耐鹽性也較高。3耐鹽能力的篩選獲得耐鹽愈傷組織一般有兩類方法,一是將外植體直接接種到含鹽培養(yǎng)基上誘導(dǎo)耐鹽愈傷組織,二是將普通的愈傷組織轉(zhuǎn)移到鹽質(zhì)量濃度恒定或逐次遞增的培養(yǎng)基上通過多次繼代,選出穩(wěn)定生長(zhǎng)的愈傷組織。前人研究表明,兩種方法都能獲得耐鹽愈傷組織,但Nabors等對(duì)煙草耐鹽離體篩選的研究認(rèn)為,在鹽脅迫條件下能否產(chǎn)生耐鹽突變體與添加鹽的質(zhì)量濃度和篩選時(shí)間有關(guān)。在低水平選擇壓力下有利于形成生理適應(yīng)性細(xì)胞,但不利于突變細(xì)胞的產(chǎn)生。選擇壓力必須大到足以抑制絕大多數(shù)細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)的程度,正常細(xì)胞幾乎不能生長(zhǎng)、分裂的情況下才有可能篩選出突變的細(xì)胞。所以本研究采用了一步直接篩選法,以期獲得真正的耐鹽突變植株,而不是鹽適應(yīng)性植株。耐鹽能力的穩(wěn)定性檢驗(yàn)需要一個(gè)長(zhǎng)期的過程,要經(jīng)過多次大田實(shí)際檢驗(yàn)才能進(jìn)一步驗(yàn)證耐鹽能力的可遺傳性,本研究的檢驗(yàn)可能與實(shí)際大田栽培中植株的耐鹽能力還有較大差距,需進(jìn)一步深入的研究探討。在篩選具有分化能力的耐鹽愈傷組織時(shí),許多材料的愈傷組織或培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)過長(zhǎng)期的抗性篩選后,喪失了再生形成植株的能力。培養(yǎng)耐鹽突變體需要長(zhǎng)時(shí)間的鹽脅迫篩選,而長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)會(huì)影響愈傷分化。本研究認(rèn)為,采用高鹽