肝口服液對原發(fā)性肝癌患者外周血細(xì)胞亞群的影響

肝口服液對原發(fā)性肝癌患者外周血細(xì)胞亞群的影響

肝炎素是治療中風(fēng)、祛瘀、益氣健脾的方法。經(jīng)過臨床和基礎(chǔ)實驗，證實對肝腫瘤患者的早期癌前病變和癌前癌有顯著的抑制作用。本研究采用流式細(xì)胞技術(shù),探討HCC患者細(xì)胞免疫功能變化和肝■口服液對HCC患者細(xì)胞免疫功能的影響。1材料和方法1.1研究主題1.1.1hcc患者的臨床分期14例,2002年5～10月我院門診及病房確診的HCC患者,根據(jù)1999年第四屆全國肝癌患者學(xué)術(shù)會議修訂的HCC診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床分期標(biāo)準(zhǔn),選擇Ⅱb期或Ⅲ期,但沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝功能Child-PughB級,不能手術(shù)并且無任何治療干預(yù)的HCC患者。男女比例1∶0.071,年齡40歲～69歲,平均58歲±10歲。1.1.2健康志愿者組織來自于我院健康工作人員30例,男女比例1∶2,年齡24歲～51歲,平均年齡33歲±9歲。1.1.3核電站高血壓患者的藥物群5例,男女比例1∶0.25,年齡50歲～69歲,平均63歲±8歲。1.1.4健康藥物組健康志愿者5例,男女比例1∶0.67,年齡29歲～48歲,平均年齡34歲±8歲。1.2給藥前血液樣本的采集對所確定研究對象均采清晨空腹血2ml,2%EDTANa2抗凝,立即送檢外周血T細(xì)胞亞群。1.3給藥后血液樣本的采集服藥對象于首次采血后,給予肝■口服液40ml/d,持續(xù)8周,于8周末再次采集清晨空腹血2ml,重復(fù)步驟1.2。1.4主試劑和設(shè)備1.4.1肝素由半枝蓮、白花蛇舌草、三棱、莪術(shù)、黃芪等組成,河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院制劑室經(jīng)水煎、濃縮及醇沉制成。1.4.2pc5、cd8-pc5單克隆抗體CD4-FITC/CD8-PF/CD3-Pc5、CD8-Pc5(Immunotech,美國Beckman-Coulter公司),CD28-PE(PharMingen美國D-B公司)。1.4.3透膜試劑細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子試劑盒,IntraPrepTMPermeabilizationReagentImmunotech,美國Beckmm-Coulter公司。1.4.4流式細(xì)胞儀為EPICSElite型流式細(xì)胞儀(美國BECKMAN-COULTER公司)。1.5細(xì)胞表達(dá)分析應(yīng)用流式細(xì)胞儀三色分析法,采取FSvSS設(shè)計方法,確定淋巴細(xì)胞群,應(yīng)用EIJTTE4.5軟件分析CD4+、CD8+、CD8+、CD28-、CD8+、CD28+細(xì)胞表達(dá)。1.6統(tǒng)計分析差異顯著性采用t檢驗。數(shù)據(jù)分析在SPSS10.0軟件下進(jìn)行,檢驗水準(zhǔn)取α=0.05。2結(jié)果2.11健康志愿者評估HCC患者外周血中CD4+下降,CD8+增高,CD4+/CD8+比值下降,與健康志愿者比較,差異具有顯著性(P均小于0.01);HCC患者CD8+CD28-增高,而CD8+CD28+降低,與健康志愿者比較,差異具有顯著性(P均小于0.01)。2.2cd8+、cd4+/cd8+檢測健康志愿者用藥前后外周血中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、CD8+CD28-、CD8+CD28+的測定值變化不明顯,P值均大于0.05;HCC患者用藥后CD4+明顯增加,P<0.05。HCC患者用藥后CD8+呈下降趨勢,CD4+/CD8+比值則呈上升趨勢,但差異無顯著性,P值為0.183和0.124,考慮與樣本量小有關(guān);HCC患者用藥后CD8+CD28-測定值明顯下降,CD8+CD28+用藥后顯著升高,P均小于0.05;HCC患者用藥后CD8+CD28-、CD8+CD28+測定值均與健康志愿者測定值接近。Table.1TheResultofTcellsubpopulationsintheHCCGroupandtheControlGroup(%)3cd8+cd28+細(xì)胞激活HCC患者常伴有多種免疫功能的損害,并隨著腫瘤的發(fā)展而加重。機(jī)體維持正常的免疫功能狀態(tài)有賴于各種免疫細(xì)胞(特別是各類T細(xì)胞亞群)之間相互協(xié)作和相互制約,以產(chǎn)生適度的免疫應(yīng)答,使之既能清除異物抗原,又不損傷機(jī)體組織。正常情況下CD4+和CD8+之間始終保持一個恒定的比例,構(gòu)成宿主細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)。任何一方過低或過高,調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失去平衡,均可引起免疫紊亂。腫瘤免疫以T細(xì)胞免疫為核心,而只有表達(dá)CD4或CD8分子時才表明T細(xì)胞進(jìn)入成熟階段。CD4+在腫瘤的免疫應(yīng)答中以Th細(xì)胞為主,可識別腫瘤細(xì)胞的可溶性抗原,在參與輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和對巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、CTL的激活過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用,來調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫,并具有維持抗腫瘤免疫記憶功能。本研究結(jié)果顯示,HCC患者與健康志愿者比較,CD4+明顯下降,CD4+/CD8+比值倒置,這與以往文獻(xiàn)報道一致,提示HCC患者T細(xì)胞亞群紊亂,細(xì)胞免疫功能明顯受抑,不能形成有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答,出現(xiàn)了負(fù)性抗腫瘤免疫作用,加重了機(jī)體免疫抑制,表現(xiàn)為清除腫瘤細(xì)胞的能力下降,使腫瘤得以持續(xù)生長。Table.2TheResultofTcellsubpopulationsintheHCCGroup&theControlGroupbeforeandaftertheMedicine(%)T細(xì)胞可激活腫瘤細(xì)胞抗原特異性CD8+CD28+的殺瘤活性。DalodM、BrinchnanJ.E、EffroseR等研究表明,CD8+CD28+和CD8+CD28-細(xì)胞是屬于同一細(xì)胞族而有不同表型的兩個細(xì)胞亞群,CD8+CD28-細(xì)胞具有短的端粒,由于抗原的慢性刺激而由CD8+CD28+細(xì)胞分化而來,分化能力比CD8+CD28+細(xì)胞低,是一種終末細(xì)胞。CD8+CD28-細(xì)胞亞群的功能至今仍不十分清楚,Colovai等認(rèn)為,CD8+CD28-細(xì)胞具有免疫抑制作用,可抑制抗體的產(chǎn)生及同種異體抗體所誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng)。因此,CD8+CD28-細(xì)胞的長期升高導(dǎo)致CD8+CD28+細(xì)胞的消耗,最終導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)對新的腫瘤細(xì)胞的無反應(yīng)性。本組研究結(jié)果顯示,HCC患者CD8+CD28-較健康志愿者明顯增高,CD8+CD28+顯著下降,表明T細(xì)胞對HCC患者癌細(xì)胞殺傷功能降低,CD8+CD28-細(xì)胞的升高,抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫,使機(jī)體不能發(fā)揮有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答,宿主不能有效清除腫瘤細(xì)胞,其結(jié)果使腫瘤逃避免疫監(jiān)視并呈不斷生長發(fā)展趨勢。肝癌在中醫(yī)屬“■積”范疇。由于機(jī)體陰陽失調(diào),氣虛脾弱,加之外感邪毒,瘀阻氣血;或情志抑郁,氣滯血瘀;或飲食失節(jié),損傷脾胃,運(yùn)化失職,濕濁內(nèi)生,終致濕濁瘀毒結(jié)于臟腑。按中醫(yī)辨證,通常將肝癌患者分為肝郁、血瘀、濕熱、脾虛等4個證型。臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示,肝癌患者多為兩個以上的證型同時存在,多以體虛(脾虛、氣虛)為本,邪實(瘀血、濕熱、痰濁)為標(biāo),治療上應(yīng)扶正祛邪、標(biāo)本兼治。肝■口服液以清熱解毒(半枝蓮、白花蛇舌草)、破瘀散結(jié)(三棱、莪術(shù)),輔以健脾益氣為治法,扶正祛邪,標(biāo)本兼治?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實,清熱解毒中藥有抗炎、細(xì)胞保護(hù)和抗癌作用;破瘀散結(jié)中藥有抗纖維化、改善肝臟微循環(huán)及抗癌作用;健脾益氣中藥有免疫增強(qiáng)作用,部分藥物有肝細(xì)胞保護(hù)作用。本試驗結(jié)果顯示,健康志愿者外周血中CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、CD8+CD28-細(xì)胞、CD8+CD28+在用藥前后均無明顯改變,表明肝■口服液對于健康志愿者細(xì)胞免疫功能影響甚微。而HCC患者用藥前后比較發(fā)現(xiàn),用藥后正性抗腫瘤免疫作用的CD4+、CD8+CD28+細(xì)胞亞群增加,負(fù)性抗腫瘤免疫作用的CD8+CD28-CD8+細(xì)胞亞群降低。這些結(jié)果表明,肝■口服液可以逆轉(zhuǎn)HCC患者細(xì)胞免疫功能明顯受抑狀況,增強(qiáng)宿主的抗瘤免疫,從而達(dá)到治療肝癌的目的。本研究還發(fā)現(xiàn),HCC患者用藥后CD8+呈明顯下降趨勢,CD4+/CD8+比值呈明顯上升趨勢,用藥后的測定值均接近于健康志愿者,但統(tǒng)計學(xué)分析差異無顯著性,這些均考慮與樣本量較小有關(guān)。綜上所述,HCC患者外周血