組織學(xué)與胚胎學(xué)實驗指導(dǎo)：注意事項及實驗緒論

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)實驗指導(dǎo)實驗須知實驗注意事項

分組實驗分一、二兩組，人數(shù)各半。組織學(xué)與胚胎學(xué)的研究方法組織學(xué)與胚胎學(xué)的學(xué)習(xí)與研究主要涉及到兩個方面：即顯微鏡觀察和標(biāo)本觀察。顯微鏡包括：光學(xué)顯微鏡(lightmicroscopy,LM)：常用于學(xué)習(xí)和研究組織學(xué)與胚胎學(xué)。電子顯微鏡(electronmicroscopy,EM)：多用于組織學(xué)與胚胎學(xué)的研究。(一)一般光學(xué)顯微鏡技術(shù)，組織切片的制作應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察組織標(biāo)本(切片)是最常用的方法。組織切片的制作：組織學(xué)切片制作比較復(fù)雜，基本包括以下幾個步驟：取材、固定、脫水、包埋、切片、染色等。取材、固定：為了盡可能使所獲得的材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)接近活體狀態(tài)，取材要迅速，得到的材料應(yīng)及時用固定液(fixative)加以固定(fixation)。常用的固定液為甲醛、乙醇等，它們可以使蛋白質(zhì)迅速凝固，防止其分解和變性。脫水、包埋、切片：為使組織與包埋劑相融合，所獲得材料需經(jīng)乙醇或丙酮脫水；為便于將材料切成薄片，則需將其包埋在石蠟或火棉膠等內(nèi)，然后再用切片機將其切成薄片。一般切片厚約5～10μm。染色：切片需經(jīng)染色后方可在顯微鏡下觀察。蘇木精、伊紅染色常規(guī)染色－蘇木精(hematoxylin)、伊紅(eosin)染色（簡稱HE染色）技術(shù)：蘇木精：是藍色的堿性染料，可將細胞核和細胞內(nèi)的某些物質(zhì)染成藍紫色；伊紅：是紅色的酸性染料，可將細胞質(zhì)染成粉紅色。對堿性染料親和力強的稱為嗜堿性(basophilia)；對酸性染料親和力強的稱為嗜酸性(acidophilia)；對兩種染料親和力都不強稱中性(neutrophilia)。甲苯胺藍（toluidine）染色技術(shù)甲苯胺藍：是藍色的堿性染料。甲苯胺藍將細胞內(nèi)、外的某些物質(zhì)染成紫紅色。這種染色現(xiàn)象稱異染性(metachromasia)。硝酸銀、氯化金染色技術(shù)硝酸銀、氯化金顆?？筛街诩毎Y(jié)構(gòu)的表面而呈棕黑色或棕黃色銀染中，有些組織結(jié)構(gòu)可直接使硝酸銀還原而顯色，稱親銀性(argentaffin)。銀染中，有些組織結(jié)構(gòu)不能直接使硝酸銀還原，必須加入還原劑方能顯色，稱嗜銀性(argentaffin)。冷凍切片技術(shù)

(frozensectionmethod)為避免細胞、組織內(nèi)的某些物質(zhì)不被固定液所破壞，又要使組織變硬，便于將其切成薄片，同時又要快速得到切片，可將獲取的新鮮組織立即用冷凍切片機(cryostat)切成冷凍切片(frozensection)

。這種方法制片迅速，細胞內(nèi)酶活性保存較好，常用于酶組織化學(xué)染色。其他技術(shù)此外血細胞、分離細胞或脫落細胞可直接涂在玻片上（涂片）；疏松結(jié)締組織可撕成薄片鋪在玻片上（鋪片）；牙和骨等堅硬組織可磨成薄片（磨片）；以上標(biāo)本再經(jīng)固定染色后顯微鏡下觀察。電子顯微鏡技術(shù)光鏡：分辨率為0.2μm，放大倍數(shù)約為1000倍；電鏡：分辨率為0.2nm，比光鏡高1000倍，可放大幾萬倍到幾十萬倍，因此電鏡能觀察到細胞的更微細結(jié)構(gòu)。在光鏡與電鏡下進行觀察，常用的長度計量單位為毫米（mm）、微米（μm）和納米（nm）。這些單位間的關(guān)系如下：μm(微米)＝10-3mm(毫米)；nm(納米)＝10-3μm(微米)透射電子顯微鏡技術(shù)

(transmissionelectronmicroscope)透射電子顯微鏡技術(shù)的組織須用戍二醛或鋨酸固定，樹脂包埋，超薄切片(厚50～80nm），再經(jīng)鉛鹽等重金屬鹽染色后，在透射電子顯微鏡下觀察。電鏡下所見的結(jié)構(gòu)稱超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)，被金屬所染部位，熒光屏上顯得暗，圖象較黑，稱為電子密度高；反之則稱為電子密度低。被檢結(jié)構(gòu)和重金屬鹽相結(jié)合的稱正染色；被檢結(jié)構(gòu)本身不與重金屬鹽結(jié)合，而其周圍染上重金屬鹽的稱負染色。一般染色都是正染色。掃描電子顯微鏡技術(shù)

（scanningelectronmicroscope）掃描電子顯微鏡技術(shù)要觀察的組織不需制成切片。固定后的標(biāo)本，在其表面噴鍍金，在熒光屏上即可顯示細胞或組織表面的立體結(jié)構(gòu)，如細胞表面的突起、微絨毛、纖毛等。冷凍蝕刻復(fù)型術(shù)

(freezeetchreplica)冷凍蝕刻術(shù)：該技術(shù)包括冷凍、斷裂、鍍鉑、分離復(fù)制面等主要步驟。冷凍蝕刻術(shù)既可以看到細胞膜外表面，又可見細胞膜的內(nèi)表面，也可探測細胞膜斷面的結(jié)構(gòu)。一般組織化學(xué)組織化學(xué)（histochemistry)方法是利用化學(xué)試劑與組織細胞內(nèi)的某些物質(zhì)呈現(xiàn)化學(xué)反應(yīng)，在局部形成有色沉淀物，通過顯微鏡觀察而對組織細胞內(nèi)的化學(xué)成分進行定位、定性和定量的研究。例如過碘酸希夫反應(yīng)，簡稱為PAS反應(yīng)（periodacidSchiffreaction）。該方法是顯示細胞內(nèi)糖原或多糖的一種方法，其化學(xué)反應(yīng)的基本過程是通過過碘酸的氧化作用，使多糖釋放出醛基，醛基與無色鹼性品紅結(jié)合反應(yīng)，于多糖存在的部位形成紫紅色沉淀物，從而證明細胞內(nèi)含有糖原或粘多糖成分。酶組織化學(xué)方法組織化學(xué)方法也可顯示酶的活性，各種不同的酶有不同顯示方法。一般來說，是將組織切片在某種酶底物中溫育，而后檢出反應(yīng)產(chǎn)物，即可知酶的存在。如顯示三磷酸腺苷酶，作用液中就含三磷酸腺苷。然后再把被酶分解的某一成分與另一物質(zhì)結(jié)合，呈現(xiàn)具有一定顏色的沉淀物，借此可在顯微鏡下觀察酶的活性強弱、存在部位等。免疫組織化學(xué)

（immunohistochemistry）免疫組織化學(xué)主要是利用抗原、抗體特異性結(jié)合的原理，檢知組織中某種多肽、蛋白質(zhì)等大分子的分布。該方法先將蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，注入某種動物體內(nèi)，使其體內(nèi)產(chǎn)生與所注入抗原相應(yīng)的抗體；而后自其血清中提取該抗體，并以熒光染料或鐵蛋白或辣根過氧化物酶等標(biāo)記；用標(biāo)記了的抗體來處理組織切片；標(biāo)記抗體與切片上相應(yīng)抗原特異性結(jié)合。因此切片中有標(biāo)記物呈現(xiàn)的部位，從而顯示該物質(zhì)在組織中的分布?？贵w如用熒光染料標(biāo)記，則可在熒光顯微鏡下觀察；如用辣根過氧化物酶標(biāo)記，再通過對此酶的組織化學(xué)顯示法處理，可在光鏡下觀察。上述以標(biāo)記抗體直接與抗原結(jié)合方法，稱為直接法。另一種方法是間接法，將分離的抗體(第一抗體，簡稱一抗）再作為抗原免疫另一種動物，制備該抗體（抗原）的抗體（第二抗體，簡稱二抗），再以標(biāo)記物標(biāo)記二抗。而后以一抗和標(biāo)記二抗處理樣品，最終形成抗原-一抗-標(biāo)記二抗復(fù)合物。間接法中的一個抗原分子可通過一抗與多個標(biāo)記二抗相結(jié)合，使抗原清楚的顯示，因此它的敏感度較高。細胞或組織培養(yǎng)技術(shù)

(cellortissueculture)將人體或動物的活細胞、活組織在體外培養(yǎng)，稱細胞或組織培養(yǎng)(cellortissueculture)

。細胞在體外生存，必需具備適宜的條件，包括營養(yǎng)、O2和CO2、比例、滲透壓、pH值、溫度和濕度。體外培養(yǎng)細胞，可人為的給以各種不同條件，研究它們對細胞的分裂、分化、結(jié)構(gòu)和功能等的影響，并可用顯微電影等記錄細胞的動態(tài)變化。組織學(xué)與胚胎學(xué)學(xué)習(xí)方法理論和實驗密切聯(lián)系組織學(xué)與胚胎學(xué)是一門以形態(tài)結(jié)構(gòu)為主的學(xué)科，許多結(jié)構(gòu)不要死記硬背，而是在實驗課中通過觀察、分析、比較，然后再記憶。這種聯(lián)系既不會感到枯燥而又能認識深刻。所以在學(xué)習(xí)時要重視實驗課這個重要環(huán)節(jié)。形態(tài)與機能的結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)總是與一定的機能密切相關(guān)。神經(jīng)細胞有細長突起的結(jié)構(gòu)特點，以傳遞神經(jīng)沖動；紅細胞含豐富的血紅蛋白，則具有結(jié)合和攜帶氧的功能；腺細胞具有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)