基于微衛(wèi)星dna標(biāo)記的zzcla長爪沙鼠群體遺傳多樣性分析

基于微衛(wèi)星dna標(biāo)記的zzcla長爪沙鼠群體遺傳多樣性分析

長爪沙鼠，也被稱為沙田鼠，屬于母乳喂養(yǎng)、牙齒科、老鼠科和沙鼠科。它主要分布在我國的主要分布地區(qū)內(nèi)蒙古及周邊地區(qū)的牧場上。這是一個開發(fā)和應(yīng)用廣泛的“多功能”實(shí)驗(yàn)動物。由于具有許多獨(dú)特的生物學(xué)特征,長爪沙鼠已被廣泛用于醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域。長爪沙鼠的腦血管不同于其他動物,有獨(dú)特的解剖特征,腦底動脈環(huán)后交通枝缺損,沒有連系頸內(nèi)動脈系統(tǒng)和椎底動脈系統(tǒng)的后交通動脈,不能構(gòu)成完整的Willis動脈環(huán),利用此特征,結(jié)扎沙鼠的單、雙側(cè)頸動脈,很容易造成腦梗塞病變。長爪沙鼠具有類似人類自發(fā)性癲癇發(fā)作的特點(diǎn),月齡不同,發(fā)作頻率也不同,尤其是生后2月齡左右的沙鼠,對非特異性因子具有感受性,有的可因癲癇發(fā)作致死。加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校Loskota等在沙鼠具有癲癇發(fā)作特點(diǎn)的基礎(chǔ)上,育成新的品系,培育出發(fā)作感受型WJL/UC和發(fā)作抵抗型STR/UC兩個品系。長爪沙鼠接種幽門螺桿菌(Hp)后可致慢性胃炎、胃潰瘍、胃癌、MALT淋巴瘤,壽命較小鼠長,可以建立Hp長期感染動物模型,其胃黏膜發(fā)生的病理改變與人類Hp感染發(fā)生的胃黏膜改變類似。近期Ohkusa等還發(fā)現(xiàn)Hp感染可致蒙古沙鼠十二指腸炎和十二指腸淺表潰瘍。沙鼠是目前較為理想的Hp感染動物模型。盡管長爪沙鼠的形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)、生理學(xué)和繁殖方法及生物學(xué)特性等已進(jìn)行了廣泛研究,但其遺傳背景的研究還不夠深入,分子標(biāo)記技術(shù)在這方面研究中具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。微衛(wèi)星DNA又稱短串聯(lián)重復(fù)或簡單重復(fù)序列,其基本構(gòu)成單位為2～6bp,多位于編碼區(qū)附近,也可位于基因內(nèi)的間隔區(qū)、外顯子、內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)域,且分布均勻,是一類用途十分廣泛的DNA分子標(biāo)記。用微衛(wèi)星作為長爪沙鼠的遺傳標(biāo)記,采用PCR技術(shù)檢測長爪沙鼠遺傳多態(tài)性,開展長爪沙鼠遺傳領(lǐng)域的研究,可以為長爪沙鼠資源的保護(hù)和開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。Neumann等用克隆方法篩選了9個微衛(wèi)星位點(diǎn)并對歐美的野生及實(shí)驗(yàn)長爪沙鼠群體進(jìn)行了研究。趙太云等從長爪沙鼠近緣物種大、小鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出8個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)。Z:ZCLA長爪沙鼠是浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心馴養(yǎng)的嚙齒類實(shí)驗(yàn)動物封閉群,已保種達(dá)40余代,為國內(nèi)維持時間最長、特性穩(wěn)定、應(yīng)用單位最多、使用量最大以及基本生物學(xué)特性研究較系統(tǒng)的第一個遠(yuǎn)交封閉群實(shí)驗(yàn)動物。Z:ZCLA長爪沙鼠是研究EHFV特性和研制流行性出血熱疫苗的首選實(shí)驗(yàn)動物。最近又用Z:ZCLA長爪沙鼠研制出雙價苗,供應(yīng)社會;衛(wèi)生部上海生物制品研究所生產(chǎn)出血熱疫苗所用長爪沙鼠原種亦來源于Z:ZCLA長爪沙鼠封閉群。但是隨著遺傳代數(shù)的增加,導(dǎo)致基因雜合度減小,出現(xiàn)基因丟失等現(xiàn)象,因此有必要對其進(jìn)行遺傳檢測,確定其遺傳多樣性水平,為群體遺傳保種方案的提出提供理論依據(jù)。微衛(wèi)星DNA的遺傳學(xué)穩(wěn)定性已作為衡量人類和動物基因組整體穩(wěn)定性的良好指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),在近交系動物中,個體間遺傳差異小,而不同近交系之間由于近交而固定的基因不同,因此遺傳差異較大,不同品系間的微衛(wèi)星DNA具有明顯多態(tài)性,而同一品系的不同個體不具有多態(tài)性。微衛(wèi)星在小鼠等近交系動物的遺傳檢測中已得到廣泛的應(yīng)用,但在長爪沙鼠近交系中的研究國內(nèi)外還未見報(bào)道。本研究以Z:ZCLA封閉群、野生群和近交系長爪沙鼠為研究對象,篩選長爪沙鼠微衛(wèi)星標(biāo)記,并應(yīng)用獲得的微衛(wèi)星標(biāo)記分析3個群體的遺傳結(jié)構(gòu)和整體遺傳概貌,檢測群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量。通過對比Z:ZCLA封閉群和野生群,判定Z:ZCLA長爪沙鼠封閉群的遺傳多樣性水平,監(jiān)測其由于長期封閉可能存在的基因丟失過多和遺傳多樣性水平降低等問題,為實(shí)現(xiàn)Z:ZCLA封閉群的可持續(xù)發(fā)展和全面實(shí)驗(yàn)動物化提供理論依據(jù)。同時,通過監(jiān)測由日本國家實(shí)驗(yàn)動物中心(NIBIO)培育而成的3個長爪沙鼠近交系,分析這3個近交系品系內(nèi)的純度,檢測其是否符合近交系的要求,通過檢測這3個近交系品系間的多態(tài)性,以期獲得各個品系的特異性位點(diǎn)和遺傳背景標(biāo)記,為國內(nèi)長爪沙鼠近交系的培育提供參考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1長規(guī)定株沙鼠Z:ZCLA封閉群長爪沙鼠:浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心馴養(yǎng)的封閉群,共采集20只,雌雄各半;野生長爪沙鼠:由陜西省疾病預(yù)防控制中心提供,采自陜西省定邊縣野外,共20只,雌雄各半;近交系沙鼠:3個品系是日本國家實(shí)驗(yàn)動物中心(NIBIO)培育而成,其中兩種為毛色有差異的品系:MGW(白毛品系)和MGB;MGR毛色為棕色,是抗癲癇的品系。1.1.2長利益限制在長7d近緣種子上的合成本次所用的17對引物參考Neumann等用克隆方法獲得的9對長爪沙鼠引物(AF200939、AF200940、AF200941、AF200942、AF200943、AF200944、AF200945、AF200946和AF2009417)和趙太云等從長爪沙鼠近緣物種大、小鼠的微衛(wèi)星位點(diǎn)中篩選出8個長爪沙鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)(D2Mit30、D6Mit102、D10Mit180、D11Mit128、ACPH、APOC3、PKC和SCN),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。1.2方法1.2.1k-n-meq-l-4-1e-3-羥基苯基-1,3,4-二氫-3,5-四甲基-3,5-四氫-1,4-四氫-3,5-吡啶二唑3-甲基稱取長爪沙鼠肝臟0.1g,攪碎后加DNA提取液至1mL,再加10μL蛋白酶K,經(jīng)酚-氯仿抽提,GeneCleanKitⅡ(Bio101)進(jìn)行純化,晾干,加200μL雙蒸水溶解,用UV2000(Amershampharmacia)紫外分光光度計(jì)檢測純度與濃度,調(diào)至100ng/μL,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr擴(kuò)增及電泳50μL反應(yīng)體系:100ng/μLDNA模板1.0μL,10×buffer5μL,25mmol/LMgCl23.0～7.0μL,20mmol/LdNTP4μL,1pmol/μL兩側(cè)引物各1μL,5U/μLTaq酶0.5μL,用雙蒸水補(bǔ)足50μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5min,然后進(jìn)行如下35個循環(huán):94℃變性1min,復(fù)性1min,溫度因位點(diǎn)而異(50～56℃)(表1),72℃延伸2min,最后72℃延伸10min。循環(huán)結(jié)束后72℃再延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10%變性聚丙烯酰胺凝膠、200V電泳2h,拍照。根據(jù)不同基因片段電泳遷移率的不同,利用Kodak成像軟件KDSZD2.0計(jì)算其片段長度。50bpDNAladder購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。1.3統(tǒng)計(jì)方法1.3.1基因頻率利用Microsatellite-Toolkit軟件計(jì)算等位基因頻率、觀察雜合度和期望雜合度。根據(jù)Botstein等的公式計(jì)算每一個群體每一個位點(diǎn)的多態(tài)信息含量。n為等位基因數(shù),pi為第i個等位基因的基因頻率,pj為第j個等位基因的基因頻率。1.3.2f-statistis的顯著性根據(jù)FSTAT程序計(jì)算F-statistics固定指數(shù),由Benferroni程序計(jì)算F-statistics的顯著性。品種間的FST值則通過GENEPOP程序算得。群體間的Reynolods’遺傳距離則由FST值算得,DR=-ln(1-FST)。1.3.3基因流動nm群體間每代繁殖成功的遷移數(shù),由FST=1/(4Nm+1)算得。1.3.3基因型分布的穩(wěn)定性d=(Ho-He)/He一般d值越接近于零,說明基因型分布越接近于平衡狀態(tài);d值越偏離零,基因型分布越偏離平衡狀態(tài)。d值為正說明雜合子過剩,d值為負(fù)說明雜合子缺失。2結(jié)果與分析2.1引物序列、復(fù)性溫度和mg2+濃度本研究所選用的17個微衛(wèi)星位點(diǎn)在Z:ZCLA封閉群和野生群中共有9個獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物,分別為AF200940、AF200941、AF200942、AF200945、AF200946、AF200947、D11Mit128、PKC和SCN,各個位點(diǎn)的引物序列、復(fù)性溫度和Mg2+濃度見表1。在3個日本近交系中共有8個位點(diǎn)獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物,分別為AF200941、AF200942、AF200945、AF200946、AF200947、D11Mit128、PKC和SCN,復(fù)性溫度和Mg2+濃度見表1。2.2遺傳分化和雜合型Z:ZCLA封閉群和野生長爪沙鼠群體中共檢測到41個等位基因,等位基因大小、期望雜合度、觀測雜合度和平均多態(tài)信息含量見表2,部分電泳圖譜見圖1。單個位點(diǎn)的等位基因數(shù)從1～7個不等,平均為4.56。對于整個群體而言,D11Mit128和PKC位點(diǎn)的期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)值最低,為0;而AF200945則擁有最高的期望雜合度和PIC值,為0.770和0.718。兩個長爪沙鼠群體的平均期望雜合度見表3,兩個群體的期望雜合度分別為:封閉群0.3704;野生群略高,為0.3893。通過每個位點(diǎn)的固定指數(shù)FIT、FIS、FST檢驗(yàn)群體的遺傳分化。兩個長爪沙鼠群體各個位點(diǎn)的F-statistics分析結(jié)果見表4。對于整個群體而言,平均分化系數(shù)為39.8%,群體內(nèi)雜合子過剩顯著。通過計(jì)算,兩個長爪沙鼠群體的Reynolds’遺傳距離為0.5075,Nm值為0.3781。兩個群體的遺傳偏離指數(shù):Z:ZCLA封閉群d值為-0.0003;野生群為0.3598,見表3。結(jié)果顯示Z:ZCLA封閉群的基因型分布接近于平衡狀態(tài),d值為負(fù)說明略微表現(xiàn)有為雜合子缺失現(xiàn)象;野生群的檢測結(jié)果顯示基因型分布偏離了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài),且表現(xiàn)為雜合子過剩。2.3pcr擴(kuò)增結(jié)果在3個近交系中共有8個位點(diǎn)(AF200941、AF200945、D11Mit128、PKC、SCN、AF200942、AF200946和AF200947)獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增結(jié)果,共檢測到11個等位基因,片段大小在140～243bp之間。獲得穩(wěn)定擴(kuò)增結(jié)果的8個微衛(wèi)星引物對3個品系內(nèi)個體間的擴(kuò)增結(jié)果均顯單態(tài)性,其中5個位點(diǎn)為純合,3個位點(diǎn)為雜合,品系內(nèi)的個體均顯示了較好的一致性。3個品系間個體的擴(kuò)增結(jié)果均顯單態(tài)性,這3個近交系品系間未顯示出多態(tài)性,未能獲得各個品系的特異性位點(diǎn)和遺傳背景標(biāo)記。結(jié)果見表5,部分電泳圖譜見圖2。3討論3.1遺傳多樣性分析微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動植物的遺傳多樣性分析,包文斌等將微衛(wèi)星標(biāo)記用于中國紅原雞和泰國紅原雞的遺傳多樣性分析,為中國家雞具有獨(dú)立的起源提供了一定的佐證;賈斌等用微衛(wèi)星標(biāo)記對新疆8個綿羊品種作了遺傳多樣性分析;段世華等用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記對我國雜交水稻主要恢復(fù)系遺傳差異作了檢測分析,但在長爪沙鼠遺傳多樣性分析中的應(yīng)用還較少。在微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)中雜合度和多態(tài)信息含量是估測群體遺傳變異度的重要指標(biāo)。作為遺傳多樣性度量的最常用雜合度指的是期望雜合度,即從一個基因庫中隨機(jī)抽出的一個位點(diǎn)的兩個拷貝為不同等位基因的概率。此雜合度值越大,群體內(nèi)的遺傳變異越大。Ott將多態(tài)位點(diǎn)定義為雜合度為0.10的位點(diǎn),本研究所分析的9個微衛(wèi)星標(biāo)記中,Z:ZCLA封閉群的期望雜合度為0.3704,野生群較封閉群高為0.3893,均顯示出較豐富的遺傳多樣性和較高的選擇潛力。多態(tài)信息含量(PIC)是衡量標(biāo)記多態(tài)性較好的指標(biāo)。Bostein等提出衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息量指標(biāo),PIC>0.5時為高度多態(tài),0.25<PIC<0.5時為中度多態(tài),PIC<0.25時為低度多態(tài)。本研究中所檢測的長爪沙鼠9個微衛(wèi)星標(biāo)記的平均多態(tài)信息含量分別為:Z:ZCLA封閉群0.3256;野生群為0.3344。表明兩個群體遺傳多樣性水平均處于中度多態(tài),且野生群要高于Z:ZCLA封閉群。有效等位基因數(shù)也是反映群體遺傳變異的一個指標(biāo),尤其在保護(hù)遺傳學(xué)中,有時更強(qiáng)調(diào)等位基因數(shù)目對種群的影響,但有效基因數(shù)目容易受到樣本量的影響。本研究的9個微衛(wèi)星位點(diǎn)中,平均等位基因數(shù)為4.56,這說明本研究的樣本量較為充分所選擇的微衛(wèi)星引物在兩個長爪沙鼠群體中所提供的多態(tài)信息含量較為豐富,用其分析遺傳多樣性具有較高的有效性和可靠性。在所分析的結(jié)果中,相對于野生長爪沙鼠群體來說,Z:ZCLA封閉群的平均期望雜合度和多態(tài)信息含量以及有效等位基因數(shù)都較野生群低,這可能是由于Z:ZCLA封閉群種群數(shù)量較小,且保種時間長導(dǎo)致近交系數(shù)有所上升等原因造成的。對于封閉群實(shí)驗(yàn)動物,遺傳多樣性一般是指品種或品系內(nèi)個體在DNA水平上的差異,遺傳多樣性減少,許多有重要價值的基因可能已經(jīng)丟失,種質(zhì)質(zhì)量和育種潛力就會降低,所以必須采取科學(xué)有效的措施來保護(hù)這個品種,防止優(yōu)良基因的丟失。兩個群體的遺傳分化系數(shù)為39.8%,表明兩個群體間的分化程度較大,而且呈雜合子過?，F(xiàn)象。通過計(jì)算,兩個長爪沙鼠群體的Reynolds’遺傳距離為0.5075,Nm值為0.3781,這兩個群體并沒有表現(xiàn)出較近的遺傳距離,且彼此之間的基因流動較小,這可能是因?yàn)閆:ZCLA封閉群的初始群體和本研究所采集的野生沙鼠地域有差別,且經(jīng)過40多代保種封閉之后由于群體內(nèi)部分位點(diǎn)近交導(dǎo)致基因丟失等原因。本研究中通過對比發(fā)現(xiàn)野生群中存在一些Z:ZCLA封閉群中沒有的基因片段,以此為參考可適當(dāng)引入野生長爪沙鼠以使Z:ZCLA獲得更多的優(yōu)良基因,提高Z:ZCLA封閉群的遺傳多樣性水平,利于其遺傳育種。本研究通過對長爪沙鼠種群結(jié)構(gòu)的分析,建立檢測遺傳多樣性的方法,為Z:ZCLA長爪沙鼠封閉群的保種研究提供