小鼠精子冷凍方法的研究進(jìn)展

小鼠精子冷凍方法的研究進(jìn)展

冷杉和低溫貯藏動物飼料是保存動物基因資源的有效方法之一。冷凍保存動物的精子與活體保存動物、冷凍保存胚胎等方法相比較,可以大大降低所用經(jīng)費和占用飼養(yǎng)動物的空間;同時又可以減少飼養(yǎng)動物可能存在的各種危險。例如:可以減少由于飼養(yǎng)不當(dāng)引起的動物死亡;可有效防止動物間疫病的傳播;可預(yù)防由于繁殖等因素引起近交系動物保種基因的漂移等。此外,冷凍精子保種,還便于運輸和進(jìn)行國際間的交流。自從1949年P(guān)olge等第1次成功地冷凍保存精子以來,包括人類自身在內(nèi)許多哺乳動物的精子均被成功地進(jìn)行冷凍并相繼報道。然而,小鼠的精子直到1990年才首次由TadaN等人和YokoyamaM領(lǐng)導(dǎo)的小組等分別冷凍成功。近20年來,小鼠精子冷凍保存方法和實用程序的建立及發(fā)展,為進(jìn)一步建立實驗動物小鼠的精子庫打下了一定的基礎(chǔ)。但是所報道的一些研究表明,早期的一些小鼠精子冷凍方法重復(fù)性很差,直到NakagataN等人報道利用棉籽糖-脫脂奶粉作為小鼠精子冷凍保護(hù)劑(R18S3)的改良小鼠精子冷凍方法發(fā)表后,這一問題才得到初步解決,并一直沿用至今。目前,利用冷凍小鼠精子對去除顆粒細(xì)胞、透明帶完整的成熟卵細(xì)胞進(jìn)行體外受精(IVF),可獲得的2-細(xì)胞期胚胎發(fā)育率為38%～88%;用這些胚胎對假孕母鼠進(jìn)行移植,約可以得到40%～63%的新生小鼠。因此,冷凍保存小鼠的精子亦被證明是保存小鼠遺傳物質(zhì),建立小鼠基因庫的一種可行技術(shù)路線。應(yīng)用改良的保護(hù)劑R18S3冷凍小鼠精子,已成功地被世界上許多實驗室利用,成為一種常規(guī)的方法[2,11,12,13,14,18]。但是,以R18S3為冷凍保護(hù)劑(CPA)的冷凍精子操作方法,針對不同的小鼠品種是有一定限制的。許多實驗表明,由于小鼠精子經(jīng)凍融后,做直線運動的精子數(shù)量會急劇地減少,減少可達(dá)50%以上。以R18S3為冷凍保護(hù)劑的小鼠精子冷凍方法,更適宜遠(yuǎn)交系和有雜合子遺傳背景的小鼠品系。而C57BL/6J及BALB/cJ,129S3/SvImJ等近交系系小鼠;以及那些以其為背景的眾多轉(zhuǎn)基因小鼠,基因敲除小鼠;對它們雜交一代(F1)的小鼠精子進(jìn)行冷凍,效果并不理想。此外,許多實驗室很難重復(fù)上述冷凍方法為基礎(chǔ)的實驗結(jié)果;某些品系的小鼠精子可進(jìn)行冷凍復(fù)蘇,而另一些品系卻很難重復(fù)。對影響小鼠精子冷凍成功率的一些基本因素,特別是小鼠精子凍融后如何影響到其受精能力,目前仍存在大量未知數(shù)。因此,如何成功地冷凍保存近交系小鼠精子,有效地提高近交系小鼠精子凍融后的成功率,對科學(xué)界來說仍是一個誘人的挑戰(zhàn)。小鼠精子對周圍環(huán)境的一些變化極為敏感,而且相比之下,反應(yīng)比其它動物精子更大[2,14,15,16,17,18,33]。例如:pH值、外界滲透壓的變化、氧化條件的類型以及各種機(jī)械刺激,如:離心和狹窄的移液槍頭等。小鼠冷凍精子的存活率,凍融后精子的受精率,亦根據(jù)小鼠的品系而定,特別是對某些近交系小鼠品系的影響更大。小鼠精子經(jīng)凍融后,直線運動的精子減少約50%以上,這一點與其它哺乳動物的精子相似。近交系C57BL/6J和129S3/SvImJ小鼠,利用新鮮采集的精子對卵細(xì)胞授精,可發(fā)育到2-細(xì)胞期胚胎的受精率分別達(dá)70%和84%;而兩者凍融后2-細(xì)胞期胚胎的受精率僅為6%。而且,C57BL/6凍融后的可直線運動精子少于10%,其隨后的受精率約在0～10%。另外,據(jù)GCharlesOstermeier和RobertATaft等研究小組報道,C57BL/6小鼠的精子在冷凍后,大約75%的精子不能存活。C57BL/6小鼠精子在凍融后進(jìn)行IVF很難。為什么精子穿透卵細(xì)胞透明帶的能力會急劇下降?一方面與凍融后存活的可做直線運動精子數(shù)量大大減少有關(guān);另一方面在進(jìn)行IVF時,凍融后受精液中存在大量死精子也是影響成功率的因素之一。近10年來,由生物醫(yī)學(xué)研究伴隨而來對突變小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠、化學(xué)誘導(dǎo)小鼠品系大量增加;實驗室、商業(yè)供應(yīng)小鼠品系在世界范圍急劇增加;隨之增加了對這些不同品系小鼠保種的需求。但是,另一方面,有效地冷凍保存小鼠精子及其復(fù)蘇后授精,產(chǎn)生活子代的成功率又太低,這已成為冷凍保存大量小鼠精子,建立小鼠精子庫的一個瓶頸。特別是大量的新建轉(zhuǎn)基因亞系來自具有C57BL/6J遺傳背景或其它近交系小鼠。對動物遺傳基因庫,同時建立多種遺傳物質(zhì)庫優(yōu)于僅對單一某種遺傳物質(zhì)進(jìn)行保存更加穩(wěn)妥可靠。精子庫是確保上述動物遺傳基因庫更有效和簡便的方法之一。精子冷凍保存與胚胎冷凍保存、卵母細(xì)胞冷凍保存相比較,不僅實驗方法簡單,而且更經(jīng)濟(jì)實惠,可大大減少所用的實驗時間和人力、物力。因此,最近許多科學(xué)工作者面對這一挑戰(zhàn),開始重新尋找或改進(jìn)針對近交系小鼠精子冷凍更加可靠有效的方法。它們包括:對新冷凍保護(hù)劑的研究(冷凍保護(hù)劑及其化合物、配伍濃度);新的冷凍方法(冷凍速率、貯存溫度等);活性氧組分(ROS)對精子冷凍保存的影響;冷凍對精子膜的影響和保護(hù)等。所有這些研究將有利于保護(hù)凍融后精子的成活和提高IVF成功率。國外對小鼠精子冷凍各方面,特別是針對C57BL/6J等近交系小鼠精子的冷凍做了大量研究。下面我們做一簡單綜述,其中包括:冷凍方法、冷凍保護(hù)劑、冷凍液的研究和改良、冷凍小鼠精子膜的傷害機(jī)理及其保護(hù)、小鼠精子凍融后授精和獲能等相關(guān)研究。1冷凍法1.1冷凍保護(hù)液質(zhì)精子細(xì)胞冷凍保存后存活能力,與其它細(xì)胞一樣受生物物理條件的限制。例如在制冷時,應(yīng)盡量避免或減少細(xì)胞內(nèi)、外冰晶的形成。傳統(tǒng)的小鼠精子冷凍方法,即由Nakagata等改良的利用棉籽糖-脫脂奶粉(R18S3)為冷凍保護(hù)劑的小鼠精子冷凍方法。在許多實驗室中,這種方法成功地被用于常規(guī)小鼠精子冷凍庫。冷凍保護(hù)液內(nèi)基本的CPA為:在適于胚胎生長的超純凈水內(nèi)含有18%的棉籽糖和3%的脫脂奶粉,其滲透壓為400～410mOsm。配好的冷凍保護(hù)液可在4℃保存10天,或是在-20℃保存6個月。棉籽糖是一種三糖,屬于非穿透性CPA。它本身不能夠進(jìn)入或穿透細(xì)胞膜。它在冷凍過程中主要為精子周圍的溶液提供高滲透壓環(huán)境,有利于細(xì)胞干燥和冷凍。脫脂奶粉含有高分子成份,主要起緩沖和稀釋作用,維持冷凍液系統(tǒng)及精子細(xì)胞膜的穩(wěn)定。利用棉籽糖-脫脂奶粉CPA的小鼠精子冷凍方法,最主要的缺點是在冷凍近交系小鼠的精子時成功率很低,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如該方法對封閉群或遠(yuǎn)交系小鼠精子的冷凍。1.2海藻糖復(fù)合保護(hù)劑最近,國外的一些研究小組發(fā)表了大量有關(guān)小鼠短期/長期脫水和凍干方法保存小鼠精子的文獻(xiàn)。脫水和凍干方法是選用海藻糖為主要的冷凍保護(hù)劑。海藻糖是一種雙糖,分子式C12H22O11,分子量為342.30g/mol。海藻糖作為一種抗氧化劑,又是一種分子生物膜保護(hù)劑,因此在小鼠精子冷凍保存時,可以作為一種膜外非滲透冷凍保護(hù)劑,起到保護(hù)小鼠精子膜結(jié)構(gòu)和對精子細(xì)胞進(jìn)行脫水的作用。但是這類脫水和凍干保存的小鼠精子,很難直接進(jìn)行IVF。經(jīng)復(fù)水后的小鼠精子,需輔助以復(fù)雜的單精子注射(ICSI)技術(shù)。通過ICSI技術(shù)支持,才能獲得新生小鼠,重新恢復(fù)凍干保存的該小鼠品系。1.2.1海藻糖保護(hù)液McGinnisLK等2005年報道了一種利用海藻糖,分別在4℃或室溫22℃條件下,脫水干燥短期保存小鼠精子的新方法。此方法無需低溫液氮和冷凍條件,僅需利用含海藻糖的保護(hù)液。精子在這種含海藻糖的保護(hù)液中短期貯存,其成活率顯著高于沒有海藻糖的溶液。經(jīng)海藻糖保護(hù)液中短期貯存,室溫22℃條件下保存1周或1個月,小鼠精子經(jīng)ICSI,可使卵細(xì)胞受精后的囊胚發(fā)育率分別達(dá)到53%和6%;4℃條件下保存2周或1個月,小鼠精子可使胚胎受精后的囊胚發(fā)育率分別達(dá)到84%或63%。1.2.2小鼠精子的實現(xiàn)是否復(fù)水VanThuanN和WakayamaT等研究小組在2008年報道了另一種利用海藻糖為冷凍保護(hù)劑,可有效延長保存小鼠精子的方法。在利用ICSI技術(shù)后,獲得了健康的子代小鼠。這一保存小鼠精子的方法,包括兩個步驟:首先小鼠精子置于含4mg/mL牛血清白蛋白(BSA)高滲透壓(800mOsmol)的KSOM培養(yǎng)基內(nèi);1)先降到維持溫度4℃;2)再儲存到-20℃。其報道的實驗結(jié)果:經(jīng)干燥低溫保存復(fù)蘇后的小鼠精子,在進(jìn)行ICSI輔助技術(shù)后,小鼠40%胚胎發(fā)育到囊胚;囊胚進(jìn)行移植后,懷孕后產(chǎn)子率達(dá)39%。在同一報道中,實驗表明,在高滲透壓(800mOsmol)的KSOM培養(yǎng)基內(nèi),室溫下1周;在-20℃下3個月保存的小鼠精子仍可利用ICSI,使雌鼠卵母細(xì)胞受精發(fā)育。利用海藻糖,無論在常溫,略高于冰點以上溫度經(jīng)脫水后保存小鼠精子,或是低溫脫水保存小鼠精子,均有很多優(yōu)點和很大的發(fā)展前途。但是,脫水保存的小鼠精子大多數(shù)失去運動能力,不能直接進(jìn)行IVF。這些小鼠精子實現(xiàn)復(fù)水后必須輔助使用復(fù)雜的ICSI技術(shù),才能使卵細(xì)胞受精、發(fā)育;再經(jīng)胚胎移植后,方可獲得健康的子代小鼠。這也是海藻糖脫水干燥保存小鼠精子較其他精子凍存方法不利的一個因素。1.3凍干小鼠精子的制備一些研究者重新研討了小鼠精子凍干的過程和最佳凍干保存的條件。一般認(rèn)為,在冷凍液中應(yīng)含有蛋白質(zhì),這樣可起到一定的穩(wěn)定作用。蛋白質(zhì)可以在冷凍一步過程中控制冰核和晶體的形成;同時在凍干的其他過程里,會影響到小鼠精子凍干的最終結(jié)果。凍干的方法是近年來研究的一種長期保存小鼠精子的方法。這種方法與冷凍保存胚胎和冷凍保存精子技術(shù)相比較更加經(jīng)濟(jì);且精子可以貯存在普通冰箱內(nèi)2個月或是在-80℃冰箱內(nèi)保存6個月以上。另有相關(guān)報道表明,如果凍干的小鼠精子儲存在-4℃的冰箱,可以保存1.5年以上;而在-196℃的液氮內(nèi)保存暫時還未能確定其上限。但是,凍干保存小鼠的精子與單純脫水保存小鼠精子的方法一樣,仍然需要利用ICSI技術(shù)才能獲得子代小鼠[25,35,39,43,60,61]。YosukeKwase和HiroshiSuzuki等在2005年、2007年;LiMW,LloydKC等在2007、2009年分別報道了利用凍干的方法,冷凍了不同品系的小鼠精子,在4℃和-80℃,C57BL/6小鼠精子可以保存2年或2.5年以上。實驗還證明了各品系的小鼠精子在ICSI技術(shù)的支持下,均可使正常胚胎經(jīng)體外培養(yǎng)發(fā)育到囊胚期或是產(chǎn)生健康的子代小鼠。同時,各品系間胚胎移植率沒有顯著差異。1.4小鼠睪丸內(nèi)精子的獲得2006年OgonukiN和他的同事們對小鼠的生殖器官或是對整個雄性小鼠的身體進(jìn)行冷凍,嘗試保存生殖細(xì)胞,包括成熟和未成熟的精子(spermatids)以保存小鼠的種質(zhì)。經(jīng)簡單地凍存,把小鼠的附睪、睪丸或整個小鼠身體在-80℃下保存1周到1年,可產(chǎn)生子代小鼠并恢復(fù)小鼠的原有品系。實驗表明,取自在-20℃保存了15年小鼠體上睪丸內(nèi)的精子,經(jīng)ICSI,也可以產(chǎn)生健康的子代。同時,上述實驗還預(yù)示了可以利用類似的方法保存和恢復(fù)某些瀕危哺乳動物。OhtaH,SakaidwY和WakayamaT等在2008年報告了冷凍部分睪丸的方法。把睪丸組織塊冷凍保存在-30℃或-80℃,至少可以保存1年以上,或經(jīng)實驗后可能保存更長的時間。利用上述來自睪丸或附睪獲得小鼠精子的方法,同樣需要輔助使用ICSI技術(shù)。選擇注射經(jīng)長期保持的睪丸內(nèi)精子,可使90%的卵細(xì)胞受精;70%的受精卵可以孵化發(fā)育到2-細(xì)胞期;而且有9.3%～12.8%的胚胎經(jīng)移植給假孕雌性小鼠,可以產(chǎn)生子代且與保存在常溫下的精子無差別。1.5小鼠精子冷凍研究2008年GCharlesOstermeier和RobertATaft等在一篇關(guān)于小鼠精子冷凍的文章中介紹,如果精子在解凍后的適當(dāng)時間增加一步預(yù)孵育,然后再進(jìn)行體外授精,它可以使有限濃度的精子更有效,可以增加IVF的成功率。2小鼠的iiif冷凍前后的培養(yǎng)基對精子非常重要,直接影響到冷凍過程中精子的存活和冷凍后的受精結(jié)果。在過去近10年里,至少有10種以上的培養(yǎng)基被用于小鼠的IVF。常規(guī)用于近交系小鼠體外受精的培養(yǎng)基主要包括HTF,TYH和MEM。LingL等2009年比較了上述各種常用的培養(yǎng)基,實驗結(jié)果顯示,MEM培養(yǎng)基更適于改進(jìn)C57BL/6小鼠及各種其亞系的精子存活。無論是對新鮮或是凍融后的精子存活和受精率,都較其他培養(yǎng)基更適用于近交系C57BL/6小鼠。3不同品系小鼠精子冷凍保護(hù)劑對利用的影響眾多的研究者致力于研究、篩選新的冷凍保護(hù)劑,以提高對近交系小鼠精子的冷凍保護(hù)和冷凍成功率。它們包括改變傳統(tǒng)的滲透或非滲透冷凍保護(hù)劑濃度,以及利用不同成份的組合試劑;篩選更適用于近交系小鼠精子冷凍的新型保護(hù)劑;有針對性地保護(hù)精子的細(xì)胞膜,以利于提高對凍融后精子獲能能力和受精能力;或是有針對性地提高凍融后保持運動的小鼠精子數(shù)量;或是根據(jù)新的冷凍方法篩選新的冷凍保護(hù)劑。冷凍保護(hù)劑類型和濃度:YildizC等在最近研究了多種不同的小鼠精子冷凍保護(hù)劑,試圖尋找針對C57BL/6等近交系小鼠更有效的冷凍保護(hù)劑組合和冷凍劑的使用濃度等各種參數(shù),以及多種不同的冷凍程序。他們的實驗包括:小鼠精子在冷凍時使用3%脫脂奶粉+0.2或0.3mol/L非穿透性冷凍保護(hù)劑棉籽糖,結(jié)合其它透性冷凍保護(hù)劑,例如:葡萄糖、丙二醇、乙二醇,或丙酮酸鈉對C57BL/6NCrBR,129S/SvPaslco和其它品系的小鼠精子冷凍進(jìn)行研究。評估包括:進(jìn)行直線運動的精子數(shù)量、質(zhì)膜的完整性、IVF率、胚胎發(fā)育率和小鼠精子的DNA分析。結(jié)果表明,利用0.3mol/L棉籽糖和0.1mol/L果糖的冷凍保護(hù)劑,可以顯著地保護(hù)CD-1,C3B6F1,B6129SF1小鼠解凍后精子活性的參數(shù);在含有0.2mol/L棉籽糖和0.1mol/L甘油或0.1mol/L果糖的冷凍保護(hù)劑,與單獨使用0.3mol/L棉籽糖為冷凍劑比較,可以顯著地提高C57BL/6小鼠精子的各項參數(shù)。但是,與本品系新鮮精子比較,凍融后以上所有品系小鼠精子DNA碎片均顯著增多。在補(bǔ)充滲透性冷凍保護(hù)劑甘油或是果糖后,對C57BL/6和129S小鼠精子可以有效保護(hù)其DNA的完整性。對C57BL/6,由于冷凍引起精子的DNA受損會顯著降低其在體外使卵細(xì)胞受精發(fā)育到囊胚期的成功率。選用不同種類的滲透型冷凍劑,包括各種單糖或多羥基化合物,適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合非滲透性冷凍保護(hù)劑,可以顯著地改善冷凍后小鼠精子的DNA完整性、IVF率和胚胎發(fā)育率。4精子頂體反應(yīng)精子在雌性生殖道內(nèi)需由一系列生化和物理變化,經(jīng)歷獲能后才能與相遇的卵細(xì)胞結(jié)合并使之受精。獲能后的精子在精子與卵細(xì)胞的接觸點,經(jīng)頂體反應(yīng),通過精子頂體膜和卵質(zhì)膜產(chǎn)生一系列的生化反應(yīng)和形態(tài)變化。近來,一些研究者針對精子的這一特性,試圖設(shè)計出新的冷凍保護(hù)程序,試圖使小鼠精子在凍融后增加或仍能保持其獲能及使卵細(xì)胞受精的能力。4.1小鼠精子的分離由于凍融后的精液中經(jīng)常增加了死精子的濃度,而這些死精子對受精是有害的。這一假說可以由分離那些無效死精子后,有效地提高IVF受精率而得到支持。在此期間,一些研究者建議在精子冷凍后,分離那些做直線運動的近交系小鼠精子,可以顯著地提高、改善小鼠精子的受精率。SzczygielMA和WhittinghamDC等在2002年報道了他們的相關(guān)研究。他們的方法是利用SephadexG25分離運動的小鼠精子。4.2氧化類型4.2.1小鼠精子的ros檢測精子使卵細(xì)胞受精的能力與其頭部質(zhì)膜所編組的活性氧組分(ROS)有關(guān)。在精子的獲能和頂體反應(yīng)中ROS扮演著極其重要的角色。同時,精子的受精能力與其頭部質(zhì)膜重組和增加細(xì)胞膜內(nèi)的鈣離子水平均與ROS有關(guān)。過多的ROS會對精子產(chǎn)生多種不利的影響,可能會嚴(yán)重地?fù)p傷精子的活性、受精能力和受精后的胚胎發(fā)育能力。通過實驗已證實,發(fā)生在小鼠獲能過程中,伴有調(diào)節(jié)酪氨酸磷酸化,這是一種小鼠精子的內(nèi)源性氧化還原反應(yīng)。小鼠精子由液體中的重碳酸鹽調(diào)節(jié)氧化反應(yīng),但這些調(diào)節(jié)可能對小鼠獲能時的酪氨酸磷酸化產(chǎn)生不利影響。同樣,在冷凍過程中,由ROS產(chǎn)生的冷凍危害在家畜已被證實,但是它的確切機(jī)制并不十分清楚。同時,冷凍-溶解后的精子的存活和受精能力是否受到ROS的影響也并不是很清楚。但是我們可以利用一些特殊的程序、防止措施和加入適量的抗氧化劑來清除液體中多余的ROS,起到保護(hù)精子的作用,有利于提高冷凍精子的活力。4.2.2精子在溶液中的添加早期的一些報道提及小鼠的精子細(xì)胞膜與其它類型細(xì)胞的膜有很大差別。由于小鼠精子的細(xì)胞膜含有多種高濃度的不飽和脂肪酸,因此在冷凍和解凍過程中,它們對由氧衍生自由基所產(chǎn)生的危害極為敏感。這些危害進(jìn)一步會影響精子的運動能力,影響精子冷凍后的存活。在冷凍液中補(bǔ)加任何自由基清除劑,例如氨基酸,它們都有可能會協(xié)調(diào)有效地去除或滅活自由基,增加精子的活力。在培養(yǎng)基中加入或補(bǔ)充一些氨基酸,還可以刺激、延長精細(xì)胞在培養(yǎng)過程的存活。L-精氨酸在精子體外培養(yǎng)中擔(dān)當(dāng)極重要的角色。它是刺激人類、山羊和其它哺乳動物精子產(chǎn)生運動,預(yù)防精子膜上產(chǎn)生脂過氧化反應(yīng)所不可缺少的。冷凍保存的精子與新鮮精子比較,其差別主要是由重碳酸引起的精子獲能。精子的質(zhì)膜在冷凍-復(fù)蘇過程中促使磷脂引起不規(guī)則變化,其變化與重碳酸誘發(fā)的精子獲能類似。當(dāng)前有研究表明,把一些必需氨基酸液,包括L-精氨酸,加入到傳統(tǒng)的CPA中,可以成為改良的mCPA。使用這些mCPA與傳統(tǒng)的CPA比較,可以顯著地增加冷凍后的精子受精率。4.3不同基因背景小鼠精子的受精率OstermeierGC等報道了一種新的冷凍保持小鼠精子方法,他們在傳統(tǒng)的棉籽糖-脫脂奶粉冷凍保護(hù)劑中添加477μmol/L的硫代甘油(又稱二羥丙硫醇,MTG)。他們對包括C57BL/6J,BALB/cJ,129S1/SvImJ等12種不同基因背景的小鼠精子進(jìn)行了冷凍保存實驗,利用冷凍麥管,以1℃/min的速率降溫,從37℃降至1℃,然后直接投入液氮中保存。結(jié)果顯示,使用凍融后小鼠精子的受精率僅略低于使用同種新鮮精子的受精率。由IVF產(chǎn)生的胚胎發(fā)育率,全部各品系小鼠的冷凍精子和新鮮精子兩者均相似或略有提高。選擇MTG,因為其在敏感的培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的無血清系統(tǒng)中是必不可少的成份。研究表明,MTG可以改善C57BL/6J小鼠精子的受精能力,但是并不增加運動精子的數(shù)量。4.4有膽固醇受體的精子膽固醇從精子頭部的膜表面流失或溢出,是精子獲能的分子生物學(xué)表現(xiàn)。模擬位于雌性生殖道液體內(nèi)的膽固醇受體,例如白蛋白和與類固醇結(jié)合的蛋白質(zhì)等,可以引起精子頭部質(zhì)膜上的去膽固醇化,使精子完成獲能。另外,在體外培養(yǎng)中為促進(jìn)精子的獲能,牛血清白蛋白可被聚乙烯醇所代替。4.5-環(huán)化糊精TakeoT和ArimaH等報告了甲基-β-環(huán)化糊精可在C57BL/6小鼠精子凍融后,改善其受精的能力。環(huán)化糊精是由6個、7個或8個吡喃葡萄糖單位組成的寡聚糖,而甲基-β-環(huán)化糊精是由7個吡喃葡萄糖單位組成的寡聚物。環(huán)化糊精可以由淀粉經(jīng)環(huán)化糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶催化,經(jīng)過大分子分解和能量降解后產(chǎn)生。環(huán)化糊精的主要功能是可攜帶其他分子并在它的疏水核端溶解脂類。在3種類型的環(huán)化糊精中,無論是自然還是人工合成的β-環(huán)化糊精,其結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定,可與激素、維生素以及脂類化合物結(jié)合。NakagataN等在1996年首次報道了β-環(huán)化糊精可以從精子頭部的膜上去除攜帶的膽固醇,有誘導(dǎo)小鼠精子獲能的能力。遠(yuǎn)交系小鼠的新鮮精子,β-環(huán)化糊精的最佳濃度是0.75mmol/L。最近NakagataN又報道了可以利用0.74～1.5mmol/L的β-cyclodextrin,在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)對小鼠精子進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)30～60min的實驗,證明其方法可以改善凍融后C57BL/6J小鼠精子的體外受精率。5ros與正離子質(zhì)膜的相關(guān)性精子使卵細(xì)胞受精的能力,除與其頭部質(zhì)膜內(nèi)的ROS有關(guān)外,同時還與其頭部質(zhì)膜內(nèi)的鈣離子濃度水平相關(guān)聯(lián),它們可以增加與卵細(xì)胞膜相互的辨認(rèn)能力。6對精子冷凍保護(hù)劑的影響在精子冷凍中遇到許多困難,有一些潛在的因素常使實驗的成功與否朦朧不清。例如:移動精子用的移液管槍頭等產(chǎn)生的機(jī)械壓力。另外,小鼠的精子特別是C57BL/6J小鼠精子對滲透壓和氧氣壓力極為敏感。因此,培養(yǎng)基和冷凍保護(hù)劑的滲透壓和來自氧自由基的氧氣壓力對小鼠精子的冷凍起至關(guān)重要的作用。ChihiroKoshimoto等測定了在不同溫度,不同濃度的甘油和棉籽糖下,滲透壓和來自自由氧基的氧氣壓力對小鼠精子的影響。實驗表明,適當(dāng)?shù)卦黾恿姿峋彌_液(PBS)中的非滲透性冷凍保護(hù)劑的濃度和滲透壓,其協(xié)同效應(yīng)可以促進(jìn)精子冷凍后的活力和運動性。在冷凍液內(nèi)含有氧化酶、18%棉籽糖,1/4濃度的PBS液體內(nèi),小鼠精子冷凍到-70℃后解凍,仍可以獲得極高比例的運動精子。7關(guān)科學(xué)家的研究熱點為提高C57BL/6J小鼠精子冷凍-溶解后的存活率和受精率,相關(guān)科學(xué)家仍在不斷嘗試了種種不同的方法。近期研究關(guān)注的熱點有許多方面,例如:尋找新型的冷凍劑和冷凍劑組合;針對C57BL/6J等近交系小鼠精子特殊的生理和生化特性,建立更實用的冷凍方法和冷凍程序。7.1抗凍劑afps抗凍蛋白(AFPs)是一類能在低溫條件下生存的生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。最早由斯坦福大學(xué)的Devries在一種極地魚———南極深海的黃蓋鰈體內(nèi)血淋巴分離到的一種抗凍的蛋白質(zhì)。AFPs可以降低黃蓋鰈體液的冰點達(dá)-2.2℃,使其體液在海水冰點以下仍能保持流動性。AFPs可以特異性地吸附于冰晶表面,防止因體液結(jié)冰所引起對機(jī)體的傷害。AFPs可以抑制冰晶的生長,但它不影響熔點,因而導(dǎo)致溶液的冰點和熔點出現(xiàn)一差值。該差值稱為熱滯活性(THA)。其后,陸續(xù)在陸地上許多昆蟲、細(xì)菌和真菌,甚至植物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了AFPs。近年來,越來越多的越冬昆蟲和植物被認(rèn)為以生產(chǎn)熱滯抗凍蛋白作為其對低溫適應(yīng)的策略。AFPs自從發(fā)現(xiàn)以來引起了許多實驗室和專家的興趣,其結(jié)構(gòu)和抗凍機(jī)制的