第三章 細胞生物學研究方法(4學時)

第三章細胞生物學研究方法

細胞生物學研究方法進行初步觀察形成可驗證的假說設計試驗收集資料解釋結果作出合理結論查閱已有知識生物學研究模式生物是基于不同物種享有共同分子機制CaenorhabditiselegansDrosophilamelanogasterArabidopsisthaliana第三章細胞生物學研究方法第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法第二節(jié)細胞組分的分析方法第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術第一節(jié)細胞形態(tài)結構的觀察方法

1光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

2

電子顯微鏡技術

(Electromicroscopy)3掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)一、光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)

普通復式光學顯微鏡技術

熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）

激光共焦掃描顯微鏡技術（LaserScanningConfocalMicroscopy）

相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）（自習）普通復式光學顯微鏡技術

分辨率是指區(qū)分開兩個質點間的最小距離普通光學顯微鏡各種顯微鏡的分辨率梯度熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）原理熒光顯微鏡技術

（FluorescenceMicroscopy）

應用

直接熒光標記技術

間接熒光標記技術(免疫熒光標記技術)

用于特異蛋白質等生物大分子的定性定位：如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

應用：綠色熒光蛋白激光共焦掃描顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）

原理：

應用： 排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，通過“光切片”觀察樣品內部結構，可重構樣品的三維結構。激光共焦掃描顯微系統(tǒng)(Confocal

System)PineTreepollen-collectedonaBio-RadMRC1024atPurdueUniversityCytometryLaboratories

利用光切片技術顯示的花粉內部結構1為轉GFP基因的煙草單細胞；2為轉SCaM1-GFP融合基因的煙草單細胞；3為轉SCaM4-GFP融合基因的煙草單細胞。

質壁分離后轉基因煙草單細胞的激光共聚焦顯微鏡觀察細胞壁細胞膜細胞核細胞壁細胞壁細胞膜細胞核細胞膜細胞核細胞核細胞膜細胞壁細胞核細胞膜二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識

電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構造

電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電子顯微鏡的基本構造電子束照明系統(tǒng)、成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識

電鏡與光鏡的比較

電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術

負染色技術

冰凍蝕刻技術

超薄切片技術

電鏡三維重構技術

主要電鏡制樣技術超薄切片技術用于電鏡觀察的樣本制備示意圖細胞超微結構

負染色技術（Negativestaining）

染色背景，襯托出樣品的精細結構，如病毒、核糖體等結構。

冷凍蝕刻技術（Freezeetching）

冰凍斷裂與蝕刻復型：主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質顆粒和膜表面結構。

電鏡三維重構技術

電鏡三維重構技術與X-射線晶體衍射技術及核磁共振分析技術相結合，是當前結構生物學（StructuralBiology）

主要研究生物大分子空間結構及其相互關系的主要實驗手段。

固定

包埋

切片

染色超薄切片技術超薄切片技術圖片示例冷凍蝕刻二、電子顯微鏡技術

電子顯微鏡的基本知識

電鏡與光鏡的比較

電鏡與光鏡光路圖比較

電子顯微鏡的基本構造

主要電鏡制樣技術

負染色技術

冰凍蝕刻技術

超薄切片技術

電鏡三維重構技術

掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

掃描電鏡

原理與應用：

電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。

CO2臨界點干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題三、掃描遂道顯微鏡

ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結構的儀器。反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。

特點：分辨率高：

側分辨率：分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.001nm

不受介質限制

非破壞性

用途：納米生物學研究領域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結構，觀察生物大分子、膜、病毒等的結構。

2.特異蛋白抗原的定位與定性

3.細胞內特異核酸的定位與定性

4.放射自顯影技術

1.離心分離技術第二節(jié)細胞組分的分析方法一、離心分離技術

用途：分離細胞器與生物大分子及其復合物

差速離心：分離密度不同的細胞組分

密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離差速離心密度梯度離心常用的介質：蔗糖、氯化銫、甘油等。二、特異蛋白抗原的定位與定性

免疫熒光技術

快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限

免疫電鏡技術

免疫膠體金技術應用：能對蛋白進行精細定位。如通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。

蛋白電泳(SDS)與免疫印跡反應(Western-Blot)免疫熒光技術圖片示例免疫膠體金技術原理與圖片示例三、細胞內特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術

（同位素標記或熒光素標記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術

（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結合）

四、放射自顯影技術

原理及應用：

利用同位素的放射自顯影，對細胞內生物大分子進行定性、定位與半定量研究；

實現(xiàn)對細胞內生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。

第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程

1細胞的培養(yǎng)2細胞工程與顯微操作技術一、細胞的培養(yǎng)

動物細胞培養(yǎng)

類型：原代培養(yǎng)細胞（primaryculturecell） 傳代培養(yǎng)細胞（s