中國三個小型豬品系的遺傳檢測

中國三個小型豬品系的遺傳檢測

豬的解剖、生理和生化機制非常相似，在科學研究中具有重要的實用價值。小型豬由于其體型小、便于操作、飼養(yǎng)費用低等特點在作為實驗動物的應用中倍受重視。我國目前的小型豬品系主要有貴州小型香豬、廣西巴馬小型豬、版納小耳豬近交系等,它們均產(chǎn)于交通閉塞、經(jīng)濟文化落后、農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)水平低下的偏僻山區(qū),由于封閉的環(huán)境、群眾習慣及自然選擇形成了其近交程度較高的特性。微衛(wèi)星DNA(microsatelliteDNA),又稱短串聯(lián)重復序列(shorttandemrepeat,STR),以1～6bp的短核苷酸為基本單位,呈串聯(lián)重復狀廣泛分布于生物體整個基因組,具有分布廣泛、多態(tài)性豐富、易于檢測、呈孟德爾共顯性遺傳等特點,被認為是各類遺傳標記中最有價值的一種。本研究利用35個微衛(wèi)星基因座對我國這3種小型豬品系進行了遺傳學檢測,以對該3種小型豬的遺傳學背景作出評價,并為其實驗動物化提供遺傳學依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1版納小耳豬近交系貴州小型香豬(12頭)由貴陽中醫(yī)學院甘世祥教授提供,廣西巴馬小型豬(12頭)由廣西農(nóng)業(yè)大學王愛德教授提供,版納小耳豬近交系(36頭,包括JB亞系10頭和JS亞系26頭)由云南農(nóng)業(yè)大學曾養(yǎng)志教授提供。3種小型豬均為利用原產(chǎn)地近交程度較高的基礎群,經(jīng)10余年封閉或近交培育而建立的品系,其中版納小耳豬近交系在近交培育過程中根據(jù)形體大小分化為JB和JS兩個亞系。1.1.2引用產(chǎn)品本試驗所用35對微衛(wèi)星引物均在中科院上海生物化學研究所合成,其序列見資料。1.1.3試劑10×buffer、Taq酶、Mg2+為Sangon公司產(chǎn)品,dNTP為BM公司產(chǎn)品。1.1.4主要設備和設備PCR擴增儀:PE公司GeneAmpPCRSystem2400型。電泳儀:BIO-RAD公司POWERPAC300型。1.2方法1.2.1提取的dna豬頸靜脈采血按照本實驗室建立的方法提取血液白細胞DNA。1.2.2taq酶活的測定反應體系30μl。其中模板DNA20～30ng,10×bufferμl3μl,Mg2+1.5～5.0mmol/L(因基因座而異),dNTP25μmol/L,引物0.5μmol/L,Taq酶1.5U。反應條件為:95℃預變性5min;94℃變性30s,49～65℃復性30s(因基因座而異),72℃延伸30s;最后72℃延伸10min。1.2.3微衛(wèi)星基因座的等位基因分析8%聚丙烯酰胺凝膠200V電泳30～50min,銀染顯色,照相。每個微衛(wèi)星基因座根據(jù)電泳遷移率判別等位基因,從大到小依次記錄為a、b、c等,無擴增條帶則為無效等位基因(0基因);并確定個體基因型。擴增帶為1條的為純合子,擴增帶為2條的則為雜合子。1.2.4基因座數(shù)據(jù)分析計算各微衛(wèi)星基因座的等位基因分別在貴州小型香豬、廣西巴馬小型豬、版納小耳豬近交系JB系、版納小耳豬近交系JS系的基因頻率。計算三品系小型豬個體樣本在35個微衛(wèi)星基因座的純合率(在該處為純合子的基因座數(shù)和全部基因座數(shù)的比率)。利用PPAP軟件包(哈爾濱醫(yī)科大學編寫)計算多態(tài)性信息含量(polymorphisminformationcontent,PIC),平均雜合度等指標;并計算各品系間的遺傳距離(Nei公式)進行系統(tǒng)聚類分析。2結果2.1小型豬的基因型特性部分擴增結果如圖1所示。根據(jù)個體基因型計算三品系小型豬個體樣本(其中版納小耳豬近交系分為JB和JS兩個亞系)在35個基因座的純合率,如表1所示。對上表三個品系的4組數(shù)值經(jīng)t檢驗結果為:貴州小型香豬與廣西巴馬小型豬之間差異顯著(0.01<P<0.05),貴州小型香豬和廣西巴馬小型豬與版納小耳豬近交系兩個亞系之間差異均非常顯著(P<0.01),版納小耳豬近交系的兩個亞系之間差異不顯著(P>0.05)。由個體基因型計算出3個品系小型豬35個微衛(wèi)星基因座各等位基因的基因頻率,并計算多態(tài)性信息含量(PIC)、平均雜合度、全部基因座平均多態(tài)性信息含量(PIC)及全部基因座平均雜合度。除了sw973在所有樣本均表現(xiàn)為單態(tài)性純合,其他34個微衛(wèi)星基因座在3個品系小型豬中呈不同程度多態(tài)性。表2為三個小型豬品系(其中版納近交系小耳豬的JB和JS亞系分別計算)全部基因座的平均PIC和平均雜合度。由表3可見,三個小型豬品系的平均PIC和平均雜合度均較低(均小于0.5)。2.2版納小耳豬的遺傳穩(wěn)定性利用PPAP軟件由Nei公式計算所得三品系間Nei氏標準遺傳距離如表3所示?？梢钥闯霭婕{小耳豬近交系的JB和JS亞系親緣關系最近,貴州小型香豬和廣西巴馬小型豬之間也有著較近的親緣關系,它們與版納小耳豬近交系之間的親緣關系略遠。據(jù)此繪制系統(tǒng)聚類圖,如圖2所示。3討論3.1微衛(wèi)星基因座的遺傳多樣性版納小耳豬近交系的基礎群為西雙版納小耳豬,主要產(chǎn)于云南西雙版納州的勐?？h、勐臘縣、景洪縣等少數(shù)民族居住的村寨,其經(jīng)過10～14代近交,已經(jīng)從原來的基礎群按體型大小分化為兩個差別很大的亞系即JB系和JS系,因此本研究把版納小耳豬近交系的兩個亞系和其他2個小型豬品系并列進行研究;貴州小型香豬及廣西巴馬小型豬的品系來源均為香豬,主要產(chǎn)于貴州省從江、三都和廣西環(huán)江、巴馬等少數(shù)民族聚居地區(qū)。這些交通閉塞的地區(qū),不僅其他豬種的血緣難以進入,而且群眾習慣于將豬進行親子交配,同胞、半同胞交配等高度近交的自繁自養(yǎng)方式。并且由于長期的自然選擇,雖近交程度較高,卻少見遺傳疾病及畸形,從而形成獨特小型豬群體。微衛(wèi)星由核心序列(1～6bp核苷酸重復)和兩側的側翼序列構成。側翼序列使微衛(wèi)星特異地定位于染色體某一部位,核心序列重復數(shù)的差異則形成了微衛(wèi)星的高度多態(tài)性。近交的結果使基因趨于純合。根據(jù)本試驗微衛(wèi)星基因座的基因分型結果,計算三品系小型豬在35個基因座的平均基因純合率,分別為貴州小型香豬(74.05%)、廣西巴馬小型豬(67.36%)、版納小耳豬近交系JB系(86.20%)、版納小耳豬近交系JS系(86.71%)。表明這3個品系小型豬的近交程度均較高。根據(jù)貴州小型香豬與廣西巴馬小型豬之間差異顯著(0.01<P<0.05),貴州小型香豬和廣西巴馬小型豬與版納小耳豬近交系的兩個亞系之間差異均非常顯著(P<0.01),版納小耳豬近交系的兩個亞系之間差異不顯著(P>0.05),因此t檢驗結果,可以認為在本試驗采用的35個微衛(wèi)星基因座貴州小型香豬的近交程度比廣西巴馬小型豬為高,版納小耳豬近交系的兩個亞系近交程度最高。和傳統(tǒng)的血型、蛋白質多態(tài)性相比,微衛(wèi)星具有更好的多態(tài)性,因此在估測遺傳距離,尤其是親緣關系較近的群體之間,以及繪制系統(tǒng)聚類圖時更為精確可靠。PIC是衡量片段多態(tài)性的較好指標,平均雜合度則反映群體遺傳變異的大小。本研究利用的35個微衛(wèi)星基因座在3個品系小型豬中顯示出不同程度多態(tài)性,測得的這3個品系小型豬平均PIC和平均雜合度均小于0.5,和其他豬種相比明顯較低。VanZeveeren等用7個微衛(wèi)星基因座研究4個比利時豬種的平均雜合度在0.54～0.67之間;Dimoski等用18個微衛(wèi)星基因座測得約克夏、大白豬(英系約克夏)的平均雜合度分別為0.53和0.60;樊斌等用27個微衛(wèi)星基因座測得湖北省3個主要地方豬種通城豬、清平豬和陽新豬的平均PIC分別為0.7433、0.6839、0.6094,平均雜合度分別為0.7489、0.6987、0.6273。這可能和三種小型豬的近交程度均較高有關。由于近交分化,群體中不斷淘汰不利基因,純化有利基因,使群體基因型趨于純合;并且在長期的封閉繁殖中沒有外來血緣加入,而導致了遺傳基因多樣性的低水平。研究結果表明,各品系間PIC值和平均雜合度的大小關系均為:貴州小型香豬>版納小耳豬近交系JS亞系>廣西巴馬小型豬>版納小耳豬近交系JB亞系。提示貴州小型香豬的遺傳多樣性較其它兩品系豐富。版納小耳豬近交系經(jīng)過10～14代近交,已經(jīng)從原來的基礎群按體型大小分化為兩個亞系即JB系和JS系,其中JB系又已分化為2個家系,JS系分化為4個家系。本研究采用的兩個亞系樣本包括了其各自所有家系,即包括了該基礎群所有遺傳信息,因此本研究進行的遺傳分析基本代表了該品系原始基礎群的遺傳信息。版納小耳豬近交系JS亞系和JB亞系分別由4個和2個近交分化家系組成,故JS亞系的遺傳多樣性和變異程度要大于JB亞系。3.2版納小耳豬的遺傳聚類分析測定群體間的遺傳距離有多種方法,如較常見的Cavalli-Sforza、Morton法等,但從遺傳學的觀點來看,遺傳距離的最適宜測度應是單位長度的核苷酸或密碼子的差數(shù)。Nei提出了一個從大量基因座的基因頻率數(shù)據(jù)估算每個基因座的平均密碼子差數(shù)的統(tǒng)計方法。本研究基于此,計算出三品系