第06講-第二章-第四節(jié)-核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)_第1頁(yè)
第06講-第二章-第四節(jié)-核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)_第2頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

第二章天然生物材料的提取制藥

生化藥物概述

氨基酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)

多肽和蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的生產(chǎn)

核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)酶類(lèi)藥物的生產(chǎn)糖類(lèi)藥物的生產(chǎn)脂類(lèi)藥物的生產(chǎn)維生素和輔酶類(lèi)藥物的生產(chǎn)§2-4核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)核酸知識(shí)復(fù)習(xí)核酸藥物的分類(lèi)核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)方法核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例核酸類(lèi)藥物的檢測(cè)思考題核酸知識(shí)復(fù)習(xí)核糖(核糖脫氧核糖)核苷嘌呤(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤)堿基核酸核苷酸嘧啶(胞、尿、胸腺嘧啶)(DNA、RNA)磷酸DNA和RNA是存在于細(xì)胞中的正常成分。DNA主要存在于細(xì)胞核中,少量(2%)存在于線粒體和葉綠體中;RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中,少量(10%)存在于核仁、核漿和染色體中。核酸的含量與細(xì)胞大小無(wú)關(guān),以生長(zhǎng)旺盛的組織細(xì)胞中含量較多,如動(dòng)物胰臟、脾臟、胸腺,植物的莖尖、根尖及各種分生組織等。一、核酸藥物的分類(lèi)(一)、具有天然結(jié)構(gòu)的核酸類(lèi)物質(zhì)如:DNA、RNA、肌苷、ATP、輔酶A、脫氧核苷酸、肌苷酸等。獲得:微生物發(fā)酵或從生物資源中提取生產(chǎn)。藥理功能:有助于改善機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝平衡,加速受損組織的修復(fù),促使機(jī)體恢復(fù)正常生理功能。著名企業(yè):珍奧集團(tuán)、GENTA公司珍奧集團(tuán)

珍奧集團(tuán)始創(chuàng)于1996年,是一家以保健品、藥品和生物制品為核心業(yè)務(wù),集研發(fā)、生產(chǎn)、銷(xiāo)售于一體的健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán),是國(guó)家級(jí)高新技術(shù)企業(yè)。珍奧集團(tuán)位于大連市雙D港,總占地面積近60萬(wàn)平方米,下轄大連珍奧藥業(yè)有限公司、大連珍奧生物技術(shù)股份有限公司、上海珍奧生物科技有限公司、大連雙迪生物科技有限公司、福建珍奧核酸有限、大連珍奧進(jìn)出口有限公司等六家生產(chǎn)型控股子公司,現(xiàn)有藥品、保健品、化妝品、功能性紡織品、核酸原料、健康整水系統(tǒng)等7大系列400多個(gè)品種,產(chǎn)品銷(xiāo)往日本、美國(guó)、瑞士、英國(guó)、意大利、加拿大等近20多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。珍奧集團(tuán)

珍奧集團(tuán)是中國(guó)最大的核酸產(chǎn)業(yè)化基地,是世界上唯一整合了核苷酸上下游全產(chǎn)品鏈的核酸企業(yè),核酸原料國(guó)內(nèi)市場(chǎng)占有率85%以上;珍奧核酸系列保健品經(jīng)上海復(fù)旦大學(xué)、同濟(jì)大學(xué)等多家國(guó)家權(quán)威部門(mén)指定的健康相關(guān)產(chǎn)品評(píng)價(jià)基地人群試食試驗(yàn)證實(shí),功效確切,安全性高,產(chǎn)品暢銷(xiāo)十幾年不衰;珍奧核糖核酸(RNA)是目前世界上唯一通過(guò)GMA-SAFE(美國(guó)食品生產(chǎn)協(xié)會(huì)-食品優(yōu)秀生產(chǎn)供方審核)認(rèn)證的RNA產(chǎn)品,企業(yè)已受邀參與第一個(gè)食品用核糖核酸國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)制定;珍奧5′核苷酸完全符合FCC(美國(guó)食品化學(xué)品法典)最新版標(biāo)準(zhǔn)要求,被多家世界頂級(jí)跨國(guó)公司用作食品添加劑,該項(xiàng)目被列為國(guó)家發(fā)改委振興東北老工業(yè)基地項(xiàng)目。在醫(yī)藥領(lǐng)域,珍奧自主研發(fā)的國(guó)家一類(lèi)新藥——注射用心肌肽是“九五”國(guó)家重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目,“十五”國(guó)家重點(diǎn)科技專(zhuān)項(xiàng)863計(jì)劃,已通過(guò)四期臨床,獲準(zhǔn)新藥證書(shū)并全面上市。

珍奧集團(tuán)

珍奧集團(tuán)與國(guó)內(nèi)外十幾家科研院所及上百位科學(xué)家建立了長(zhǎng)期穩(wěn)定的科研合作關(guān)系。包括國(guó)際免疫聯(lián)合會(huì)前主席青克納格爾博士在內(nèi)的12位諾貝爾獎(jiǎng)得主曾走進(jìn)珍奧生命園,并對(duì)珍奧科研項(xiàng)目和科研實(shí)驗(yàn)活動(dòng)進(jìn)行了評(píng)價(jià)和指導(dǎo)。截至目前,珍奧集團(tuán)擁有專(zhuān)利近百件,被評(píng)為“國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)試點(diǎn)單位”。

珍奧集團(tuán)貫徹“寧失一萬(wàn),不失萬(wàn)一”的質(zhì)量方針,嚴(yán)格執(zhí)行健康食品和藥品生產(chǎn)的國(guó)際安全準(zhǔn)則,先后通過(guò)了ISO9001國(guó)際質(zhì)量管理體系認(rèn)證、HACCP國(guó)際食品安全預(yù)防控制體系認(rèn)證、ISO22000國(guó)際食品安全管理體系認(rèn)證、ISO14001國(guó)際環(huán)境管理體系認(rèn)證、藥品和保健食品GMP等認(rèn)證。此外,珍奧還獲得了美國(guó)FDA企業(yè)注冊(cè)資格和產(chǎn)品通關(guān)檢驗(yàn),以及日本厚生省健康產(chǎn)品準(zhǔn)入認(rèn)證。一、核酸藥物的分類(lèi)(二)、天然堿基、核苷、核苷酸的類(lèi)似物或聚合物如:三氟代胸苷、疊氮胸苷、拉米夫定(嘧啶類(lèi))、阿德福韋(嘌呤類(lèi))、恩替卡韋(第三代核苷類(lèi)抗乙肝病毒藥物)等。獲得:由自然結(jié)構(gòu)的核酸類(lèi)物質(zhì)通過(guò)半合成生產(chǎn)。藥理功能:治療病毒病如乙肝、腫瘤、愛(ài)滋病的重要藥物,也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制劑的臨床藥物。二、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)方法(一)核酸類(lèi)藥物的原材料除病毒外,所有的動(dòng)植物組織中都含有核酸類(lèi)物質(zhì),包括大分子DNA和RNA、小分子的核苷酸、核苷、堿基等成分,但不同的組織中含量有所不同。動(dòng)物胸腺中DNA含量較多,是提取DNA的原料;酵母細(xì)胞中RNA含量最多,是提取生產(chǎn)RNA的主要原料。二、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)方法(二)DNA和RNA的生產(chǎn)方法1、分離提取核酸的生產(chǎn)一般采用提取法,即從粉碎、破裂的生物組織細(xì)胞中通過(guò)一定的方法獲取總DNA或總RNA。如需進(jìn)一步的純化,常用純化方法如柱層析、凝膠電泳和密度梯度超離心。2、人工合成獲取大分子核酸的另一方法是人工合成,即利用化學(xué)的方法按照設(shè)定的核苷酸順序逐一加入形成核酸?,F(xiàn)已有核酸合成儀,但合成長(zhǎng)度還有一定限制,并且該儀器價(jià)格昂貴。因此這種方法一般用于研究,不適合生產(chǎn)。二、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)方法(三)核苷酸、核苷及堿基類(lèi)似物的生產(chǎn)方法酶解法、半合成法、發(fā)酵法1、酶解法生產(chǎn)酵母,從酵母中提取RNA,RNA經(jīng)青霉菌屬或鏈霉菌屬等微生物產(chǎn)生的酶進(jìn)行酶解,制成各種核苷酸。2、半合成法微生物發(fā)酵與化學(xué)合成并用。3、直接發(fā)酵法采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株或營(yíng)養(yǎng)缺陷型兼結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性菌株來(lái)發(fā)酵大量生產(chǎn)目的核苷或核苷酸。三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例(一)DNA的生產(chǎn)技術(shù)1.提取原理在細(xì)胞內(nèi)的核酸通常是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物——核糖核蛋白(RNP)和脫氧核糖核蛋白(DNP),這兩種復(fù)合物在不同電解質(zhì)溶液中的溶解度有較大差異。RNA+pro.→RNP(核糖核蛋白)DNA+pro.→DNP(脫氧核糖核蛋白)0→0.14MNaCl溶液DNP溶解度逐漸降低,RNP的溶解度很大;0.14M→0.5MNaCl溶液DNP溶解度逐漸增加。在制備DNA時(shí),可利用0.14MNaCl溶液使DNP與RNP分開(kāi)。由于DNP在濃鹽溶液中的溶解度比稀溶液大得多,所以,首先采用濃鹽溶液(1~2M)盡量抽提DNP,然后再去除雜蛋白。三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例2.工藝路線[抽提]豬脾臟[預(yù)處理]

冷凍,絞碎

組織漿液[預(yù)處理]

0.1MNaCl-0.5M檸檬酸混合液,離心沉淀1.71MNaCl

上清液(DNP)沉淀(DNP)溶解液0.14MNaCl沉淀物白色纖維狀DNA10%NaCl上清液(DNA)氯仿-異戊醇95%乙醇真空干燥三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例3.工藝過(guò)程取鮮豬脾,去脂、血,稱取10g,用預(yù)冷的1×SSC溶液洗2次,剪碎。

按睥:1×SSC=1;5W/V加入50ml預(yù)冷的1×SSC,用高速組織

搗碎機(jī)破碎8次,每次5秒,中間間隔30秒。將勻漿液放在燒杯中,于冰鹽浴中冷卻30分鐘。4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘。充掉上清。沉淀物中再加2倍體積的1×SSC攪勻,離心,棄上清,重復(fù)2次。將所得沉淀懸于5倍體積的PH8.0、0.15MNaCL—0.1Na2MEDTA溶液中。邊攪拌邊漫漫滴加5%SDS最終濃度達(dá)1%為止。然后加入固體氯化鈉使其最終濃度達(dá)1mol/L,繼續(xù)攪60分鐘,以確保氯化鈉全溶。所得混合液倒入磨口塞的錐形瓶中,加入同體積氯仿—異戊醇(24:1,體積比),激烈振蕩20分鐘,4000r離心20分鐘,上層水相取出后倒入燒杯,以同積氯仿—異戊醇重復(fù)去蛋白2次。取出水相于燒杯中,逐漸加入2倍體積95%乙醇,玻棒攪動(dòng),DNA纖維繞于璃玻棒上后擠干,用70%乙醇洗DNA纖維2次,用95%乙醇洗一次,再用乙醚洗一次,取出并擠干。三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例(二)RNA的生產(chǎn)1、來(lái)源:微生物——酵母通常在細(xì)菌中RNA占5~25%,在啤酒酵母中占2.7~15%,在霉菌中占0.7~28%,面包酵母含RNA4.1~7.2%。酵母菌體提取優(yōu)點(diǎn):(1)收率高;(2)提取容易。三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例2、RNA的提取——等電沉淀法酵母菌體提取液抽提清液RNA粗品RNA精品稀NaOH,提取中和,分離洗滌、干燥pH2.53、工藝過(guò)程(1)預(yù)處理:壓榨、除水;(2)提?。?.13%NaOH,使細(xì)胞壁變性,使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái);(3)中和、除菌體;(4)分離:等電點(diǎn)法,調(diào)pH2.5,使RNA沉淀下來(lái);(5)洗滌、干燥三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例(三)ATP制備腺嘌呤前體

腺苷AMPATP枯草桿菌160(Smr+Try-+Pur-)微生物或化學(xué)轉(zhuǎn)化微生物枯草桿菌160(Smr+tyr-+pur-)菌株,在添加腺嘌呤(由丙二氰化學(xué)合成)的培養(yǎng)基上培養(yǎng),可以大量累積腺苷。也可使用發(fā)酵法直接生產(chǎn)ATP,所用菌種是產(chǎn)氨短桿菌ATCC6872。三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例(四)輔酶A的生產(chǎn)1.結(jié)構(gòu)與性質(zhì)是ADP的衍生物或類(lèi)似物,相對(duì)分子質(zhì)量為767.54.高純度為白色無(wú)定型粉末,具典型硫醇味,有吸潮性,易溶于丙酮、乙醚和乙醇。兼有核苷酸和硫醇的通性,易被過(guò)氧化氫、碘或高錳酸鉀等氧化失活成二硫化物,制劑需加穩(wěn)定劑,最好充氮保存。三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例(四)輔酶A的生產(chǎn)TCA,除蛋白新鮮豬肝【絞碎】

肝漿

【水,提取】提取液濾液GAM樹(shù)脂GAM-CoACoA濃集液LD-601-CoACoA粉HCl-NaClCoA酸化液HCl,酸化LD-601,再吸附酸化濃縮液濃縮上清液沉淀物丙酮沉淀脫水干燥2.生產(chǎn)工藝三、核酸類(lèi)藥物的生產(chǎn)實(shí)例(四)輔酶A的生產(chǎn)3.生化功能

提供機(jī)體能量輔酶A是體內(nèi)70多種酶反應(yīng)通路的輔助因子,包括糖類(lèi)的分解,脂肪酸的氧化,氨基酸的分解,丙酮酸的降解,激發(fā)三羧酸循環(huán),提供機(jī)體生命所需90%的能量.提供活性物質(zhì)輔酶A參與機(jī)體大量必需物質(zhì)的合成.在腦部合成神經(jīng)肌肉信使和神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿以及促進(jìn)睡眠的褪黑激素(melatonin)等.神經(jīng)肌肉信使可在神經(jīng)和肌肉之間交換資訊,神經(jīng)遞質(zhì)可在神經(jīng)和大腦之間傳遞情感、外界刺激、記憶、學(xué)習(xí)等方面的資訊.傳遞?;饔幂o酶A是重要的乙酰基和?;鶄鬟f體.激活免疫作用輔酶A支持機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)有害物質(zhì)的解毒、激活白細(xì)胞、促進(jìn)血紅蛋白的合成、參與抗體的合成.促進(jìn)結(jié)締組織形成和修復(fù)輔酶A能促進(jìn)結(jié)締組織成分硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸的合成,對(duì)軟骨的形成、保護(hù)和修復(fù)

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