電泳+DNA體外重組技術(shù)1st

DNA體外重組技術(shù)

生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所概念

是在分子水平上，根據(jù)人們的需要以人工的方法取得感興趣的目的基因，在體外與載體DNA分子重組，然后將

重組分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，并篩選出能表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、擴(kuò)增，成為克隆。步驟

1.分離或合成感興趣的目的基因及載體分2.構(gòu)建、改造作為載體的DNA切3.目的基因與載體DNA在體外重組接4.重組DNA引入受體細(xì)胞轉(zhuǎn)5.陽(yáng)性重組子的篩選、鑒定、擴(kuò)增篩replicationtranslationtranscriptionreplicationtranscriptiontranslation一、目的基因的獲得

1.從染色體DNA中直接分離2.人工合成3.由mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA4.從基因組文庫(kù)中篩選目的基因5.PCR獲得二、載體的選擇

1.能在宿主細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制，并能攜帶重組DNA

片段一同擴(kuò)增；2.有合適的限制性酶切位點(diǎn)便于進(jìn)行克隆；3.有一定的篩選標(biāo)記，易于識(shí)別和篩選；4.載體分子應(yīng)盡量小，可插入較大的外源DNA而不影響復(fù)制；5.表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件；6.生物安全性好。。

可將外源DNA攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞的DNA稱為載體。常用載體質(zhì)粒病毒

噬菌體三、連接

用DNA連接酶將目的基因與載體連接

重組子。EcoRIEcoRI四、轉(zhuǎn)化把以質(zhì)粒為載體的重組DNA，在一定條件下引入受體細(xì)胞的過(guò)程稱轉(zhuǎn)化。以噬菌體或病毒構(gòu)建的重組DNA引入受體細(xì)胞的過(guò)程稱轉(zhuǎn)染。接受了重組DNA的受體菌稱為轉(zhuǎn)化子或重組體。轉(zhuǎn)化的方法感受態(tài)細(xì)胞及其特點(diǎn)注意事項(xiàng)五、篩選

在轉(zhuǎn)化過(guò)程中,并非每個(gè)宿主細(xì)胞都被轉(zhuǎn)化；即使獲得轉(zhuǎn)化的細(xì)胞,也并非都含目的基因，可能含有自身成環(huán)的載體分子、一個(gè)載體與兩個(gè)外源DNA形成的重組子、或插入的非目的基因與載體形成的重組子等。因此轉(zhuǎn)化后須在不同層次,不同水平上進(jìn)行篩選，以區(qū)別轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子、重組子與非重組子，以及鑒定所需的特異性重組子。Pseudo-positivepositive(一)根據(jù)重組子的遺傳學(xué)特性篩選(平板篩選)1.插入失活

2.插入表達(dá)

3.營(yíng)養(yǎng)素依賴表型

4.α-互補(bǔ)(藍(lán)白斑篩選法)(二)限制酶圖譜篩選(電泳篩選法)(三)核酸雜交篩選(四)免疫化學(xué)篩選篩選方法分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)安排第一次實(shí)驗(yàn)：質(zhì)粒提取、鑒定（pGEX-2TK-SP1

/pUC18）。第二次實(shí)驗(yàn)：酶切質(zhì)粒，回收目的片段，將目的基因與載體連接。第三次實(shí)驗(yàn)：制備感受態(tài)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli及表型篩選。質(zhì)粒概念：細(xì)菌染色體之外、能夠獨(dú)立復(fù)制、可賦予宿主細(xì)胞一定生物學(xué)性狀的共價(jià)閉環(huán)雙鏈DNA。特性:

雙鏈、閉合環(huán)狀DNA，1-200kb；常含有編碼某些酶的基因。分型：嚴(yán)緊型與松弛型。構(gòu)型：超螺旋型SC結(jié)構(gòu)致密跑得快電泳時(shí)最快。開環(huán)型OC體積最大,不易從膠孔中穿過(guò)。線型LC居中。分離:將質(zhì)粒與細(xì)菌的染色體DNA、RNA、蛋白等分離。

堿裂解法、煮沸法、去污劑法等。實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA的原理基于質(zhì)粒DNA與染色體DNA變性與復(fù)性的差異。

分子大小構(gòu)型pH12.6pH4.8質(zhì)粒DNA小環(huán)狀變性不完全復(fù)性染色體DNA大環(huán)狀完全變性不能復(fù)性操作流程質(zhì)粒提取見實(shí)驗(yàn)教材p89質(zhì)粒鑒定瓊脂糖凝膠電泳灌膠：膠中加入熒光染料(SYBRGreenI)加樣：質(zhì)粒+上樣緩沖液混勻電泳結(jié)果觀察：UV燈下電泳技術(shù)電泳的基本原理帶電顆粒在電場(chǎng)作用下向著與其電性相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，稱為電泳。帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)。是生化與分子生物學(xué)的重要研究方法之一，可用于樣品分離、物質(zhì)純度分析和分子量的測(cè)定等。一.定義帶有電荷的生物分子在電場(chǎng)作用下可發(fā)生移動(dòng)。由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)、數(shù)量以及分子量各不相同，在同一電場(chǎng)作用下，各組分的泳動(dòng)方向和速度也各有差異，所以在一定時(shí)間內(nèi)，它們移動(dòng)距離不同，從而可達(dá)到分離鑒定的目的。二.基本原理在一定pH條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時(shí)間內(nèi)它們?cè)谙嗤妶?chǎng)中泳動(dòng)速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進(jìn)行分離、分析和鑒定的基本原理。

-+泳動(dòng)度設(shè)一帶電粒子在電場(chǎng)中所受的力為F，則

F=QE（Q為粒子所帶電荷，E為電場(chǎng)強(qiáng)度）根據(jù)Stoke定律，一球形分子在溶液中運(yùn)動(dòng)所受的阻力F’為：F’=6πrηv（v為分子移動(dòng)速度；r為分子半徑；η為介質(zhì)黏度）

當(dāng)分子達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，

F=F’

即QE=6πrηv

移項(xiàng)得v/E=Q/6πrηv/E表示單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)速度，稱為遷移率，也稱電泳速度，以表示。因此上式也可表示為：

=Q/6πrη

從上式可得到以下結(jié)論帶電粒子在電場(chǎng)中的移動(dòng)與:

粒子大小有關(guān)，顆粒直徑愈小愈快粒子的電荷有關(guān)，電荷愈多愈快粒子的形狀有關(guān)，愈接近球形愈快三、影響遷移率的因素1.電場(chǎng)強(qiáng)度電場(chǎng)強(qiáng)度是指每厘米的電位降凝膠兩端距離20厘米，電壓降200伏特，電場(chǎng)強(qiáng)度為10伏特/厘米電場(chǎng)強(qiáng)度越高電泳速度越快2.溶液的PH值

PH值決定帶電顆粒的解離程度，決定物質(zhì)所帶凈電荷的多少3.溶液的離子強(qiáng)度緩沖液的離子強(qiáng)度越高，電泳速度越慢一般在0.02-0.24.電滲現(xiàn)象在電場(chǎng)中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)紙或纖維素帶負(fù)電荷，使其接觸的水溶液帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)。應(yīng)盡量避免選用有電滲作用的支持物四、電泳的分類按電泳的原理來(lái)分，可分為二類：自由界面電泳：又稱移動(dòng)界面電泳，是指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。其裝置復(fù)雜，價(jià)格昂貴，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不便于推廣應(yīng)用。區(qū)帶電泳：是指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用主要是防止電泳過(guò)程中的對(duì)流和擴(kuò)散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質(zhì)不同以及技術(shù)上的差異，又可分為不同的類型。支持物物理性質(zhì):濾紙及其他纖維素薄膜電泳、凝膠電泳、粉末電泳、線絲電泳支持物裝置形式分類：平板式電泳、垂直板式電泳、連續(xù)電泳、圓盤電泳按pH的連續(xù)性分類：連續(xù)pH電泳、非連續(xù)pH電泳瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對(duì)大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測(cè)。其分辨率較高。聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acry-lamide，簡(jiǎn)稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，簡(jiǎn)稱Bis