白花敗醬草抗腫瘤活性部位的篩選

白花敗醬草抗腫瘤活性部位的篩選

雌花草起源于神農(nóng)本草經(jīng)。它分布廣泛，具有清熱除濕、活血化瘀、解毒排膿等功效。白花敗醬出自《本草綱目》,系敗醬科敗醬屬植物白花敗醬PatriniavillosaJuss.的干燥全草,1977年版《中國藥典》將其收載為正品敗醬草。近年來,敗醬草的抗腫瘤作用日益引起關(guān)注,但對其抗腫瘤活性部位的實驗數(shù)據(jù)并不充分,結(jié)論尚不統(tǒng)一。作者通過白花敗醬草粗提物及大孔樹脂分離各部位對體外腫瘤細胞抑制作用的研究,初步篩選并判斷白花敗醬草的抗腫瘤活性部位。1材料表面1.1特芬材料白花敗醬草:購自于河北安國縣藥材市場(批號20100823),經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學生藥學教研室孟祥才副教授鑒定為白花敗醬草正品。1.2藥物、藥品與儀器1640培養(yǎng)基干粉購自Gibco公司、胎牛血清購自天津灝洋生物制品公司;噻唑藍(MTT)購自Sigma公司;蘆丁對照品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司,批號:101030);齊墩果酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110709-200505);NAPCO公司model5410型CO2培養(yǎng)箱;BioTek公司MQX200型微孔板掃描酶標儀;北京普析通用儀器有限責任公司TU-1901型紫外可見分光光度計;梅特勒托利多公司MET-TLERAE240型電子分析天平;AB-8型大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)。1.3細胞株的選擇人宮頸癌細胞Hela細胞株、人乳腺癌細胞Mcf-7細胞株、人肝癌細胞Bel-7402細胞株、人膀胱癌細胞EJ細胞株和人結(jié)腸癌細胞Hct-8細胞株均購自于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心。在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液、飽和濕度、飽和溫度為37℃,CO2濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2方法2.1粗提物的制備將白花敗醬草干燥全草截斷約0.5cm長度后,稱取100g藥材,用10倍量70%乙醇水加熱回流1.5h,共2次。合并提取液減壓回收溶劑后,得浸膏,凍干后得粗提物凍干粉7.01g。在層析柱(Φ4cm×H30cm)中裝入經(jīng)過預(yù)處理的300gAB-8型大孔吸附樹脂,干法上樣。依次用5倍柱體積的水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇洗脫,分別減壓濃縮,凍干后得各部位。根據(jù)徐潔昕的實驗方法對白花敗醬草的粗提物及5個樹脂部位的總皂苷和總黃酮進行含量測定。2.2白色斑點草提取物對腫瘤細胞的抑制作用2.2.1dmso濃度精密稱取白花敗醬草粗提取物10mg,加磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解至5g·L-1,用含10%滅活新生小牛血清RAPM1640培養(yǎng)基將其稀釋成10,50,250,1250mg·L-1溶液,過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?。精密稱取白花敗醬草各部位10mg,用DMSO溶解,用培養(yǎng)液稀釋至10ml,制成1g·L-1溶液。再用培養(yǎng)液稀釋成2,10,50,250mg·L-1溶液。DMSO最終濃度小于0.05%,在該濃度下DMSO對細胞的生長無影響。過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆?。精密稱取H2O部位10mg,用培養(yǎng)液溶解并稀釋至10ml,制成1g·L-1溶液。再用培養(yǎng)液稀釋,分別配制成2,10,50,250mg·L-1溶液,過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2測定指標及方法采用四甲基偶氮唑藍比色法。選取對數(shù)生長期的Hela、Mcf-7、Bel-7402、EJ、和Hct-8細胞,調(diào)整細胞濃度至3×104個/ml,分別接種于96孔板上,每孔100μl。培養(yǎng)24h后加藥,對照調(diào)零組加入100μl培養(yǎng)基作本底,實驗組分為空白對照組和受試藥組,每組設(shè)三個復(fù)孔。受試藥組藥物終濃度為50μg·ml-1,終體積為200μl,空白對照組加入等體積RAPM1640不完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔加入20μl濃度為5mg·L-1的MTT。培養(yǎng)結(jié)束后,小心吸棄培養(yǎng)基,每孔加入DMSO(二甲基亞砜)150μl,輕輕震蕩10min后,用酶標儀于570nm處測定吸光度(A)值,測定時需減去空白對照的A值。細胞生長抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%3結(jié)果3.1表1顯示了粗提物及其各部分中總羥基磺酸和總黃酮的含量3.2ic50值,當對于白花敗醬草粗提物,Mcf-7細胞最敏感,IC50值達22mg·L-1。Hela細胞、Hct-8細胞和EJ細胞次之,Bel-7204細胞較差。結(jié)果見表2。3.3樹脂組織部位對hela和mcf-7和hct-8細胞生物抑制作用的影響濃度為250mg·L-1的80%乙醇樹脂部位對Hela、MCF-7、HCT-8和EJ細胞的抑制率都達到80%以上,IC50值均小于100mg·L-1。20%乙醇樹脂部位和H2O樹脂部位對Hela、MCF-7和HCT-8細胞的抑制率很弱,IC50值均大于250mg·L-1。由此可知白花敗醬草的抗腫瘤活性主要集中在80%樹脂部位。結(jié)果見表3。4體外抗腫瘤活性近年來研究表明敗醬屬植物具有一定的抗腫瘤作用,其含有的黃酮醇、齊墩果酸、多糖、異香豆素糖苷和揮發(fā)油等活性成分在體外能抑制人宮頸癌Hela細胞增殖。但是,目前針對白花敗醬草的抗腫瘤活性部位說法不一,其皂苷部位、黃酮部位以及水提液部位已被證實具有一定的藥理活性。如張永強等研究了敗醬草通過正丁醇萃取的總皂苷部位對U14荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤的抑制作用,并推測敗醬草皂苷通過增強機體抗氧化能力而清除體內(nèi)過多的氧自由基而達到抗腫瘤作用。楊曉蕾實驗得出白花敗醬草乙酸乙酯萃取獲得的總黃酮部位具有體外誘導Hela細胞凋亡作用和對U14荷瘤小鼠的體內(nèi)抗腫瘤活性。陳磊等實驗說明白花敗醬草水提液可以誘導腫瘤細胞損傷。鑒于白花敗醬草的抗腫瘤活性部位處于不明確狀態(tài),作者建立70%醇提后經(jīng)大孔樹脂分離的純化工藝,將白花敗醬中的總黃酮和總皂苷部位盡量分開,利用紫外顯色法測定各部位總黃酮和總皂苷含量,之后采用MTT法分別進行抗腫瘤細胞的篩選以及抗腫瘤活性部位的考察,更直觀地篩選出總皂苷是白花敗醬草的抗腫瘤活性部位。本實驗選擇Hela、Mcf-7、EJ、Hct-8和Bel-7402五種人腫瘤細胞系,針對白花敗醬草粗提物分別考察了這五種腫瘤細胞的敏感性。本研究中MTT試驗發(fā)現(xiàn)對于白花敗醬草粗提物,Hela、Mcf-7、EJ和Hct-8細胞株具有一定的敏感性,IC50值均小于250mg·L-1,其中Mcf-7細胞和Hela細胞最為敏感,IC50值分別是22mg·L-1和57mg·L-1。提示其藥理作用可能主要表現(xiàn)在抑制婦科腫瘤宮頸癌和乳腺癌方面。同時分別設(shè)計了10,50,250,1250mg·L-1四個濃度考察粗提物的腫瘤細胞抑制率,發(fā)現(xiàn)粗提物在抑制腫瘤細胞體外增殖方面具有一定的劑量-效應(yīng)依賴性。因此,本課題組對粗提物進一步分離純化,通過體外抗腫瘤實驗?zāi)Ｐ?篩選白花敗醬草的抗腫瘤活性部位并客觀評價其抗腫瘤活性。實驗結(jié)果顯示,80%乙醇樹脂部位對Hela、Mcf-7、EJ和Hct-8細胞株的IC50值較粗提物均明顯降低,并且對Hela和Mcf-7細胞株的抑制效果最明顯,IC50值分別為11.9mg·L-1和12.55mg·L-1。此外20%樹脂部位和H2O樹脂部位對Hela、Mcf-7和EJ雖具有一定的抑制作用,但其抑制率較低,IC50值均大于250mg·L-1。綜合以上結(jié)果,80%乙醇樹脂部位對Hela和Mcf-7細胞株具有顯著的抑制作用,提示80%乙醇樹脂部位可作為白花敗醬草的抗婦科腫瘤的有效部位。顯色法測得活性部位的總皂苷和總黃酮的含量分別是61.81%和8.69%,因此可確定總皂苷部位是白花敗醬草抗婦科腫瘤有效部位。本試驗通過白花敗醬草總皂苷對人體腫瘤細胞抑制率的考察,明確了白花敗醬草總皂苷的抗婦科腫瘤活性,填補了其總皂苷抗腫瘤的體外研究數(shù)據(jù)的空白。另外,本試驗中黃酮成分主要集中在40%乙醇樹脂部位,其總黃酮含量達51.61%。MTT試驗結(jié)果顯示此部位對Hela、Mcf-7、EJ和Hct-8細胞株均無明顯的抑制作用。此試驗結(jié)果與楊曉蕾等人的試驗結(jié)果不同,作者分析其原因,可能是因為提取方法不同造成的。近年來,婦女宮頸癌和乳腺癌的發(fā)病率逐漸上升,其治療費用