1株產(chǎn)氨肽酶的米曲霉產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究

1株產(chǎn)氨肽酶的米曲霉產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究

氨基酸酶是指含有氨基酸和蛋白質(zhì)的酶。根據(jù)作用方式，可分為兩類：從氨基或羧基末端去除活性物質(zhì)，從多酚鏈中分解內(nèi)酶，并對(duì)氨基或羧基末端進(jìn)行解碼。氨肽酶(aminopeptidase)是外肽酶之中的一大類別,它是一種能夠催化肽鏈氨基末端肽鍵水解的蛋白酶。氨肽酶能夠在肽鏈的氨基末端逐個(gè)順次水解下相應(yīng)的疏水性氨基酸。其中有些不但能水解多肽,還具有水解完整蛋白質(zhì)分子的能力。氨肽酶作為自然界中重要且普遍存在的蛋白酶類的一種,廣泛存在于各種動(dòng)物、植物以及微生物中。氨肽酶在動(dòng)物體內(nèi)主要存在于消化系統(tǒng)中幫助消化,是動(dòng)物腸液的重要組成。動(dòng)物的血液、肌肉、其他內(nèi)臟和腦中也存在氨肽酶,研究表明,腦中的氨肽酶對(duì)高等動(dòng)物的激素調(diào)節(jié)等方面具有重要意義。多種不同類別的微生物都有生產(chǎn)氨肽酶的能力,且所產(chǎn)氨肽酶種類和產(chǎn)量也不盡相同。有的種類比較單一,而有的能產(chǎn)多種種類的氨肽酶。無(wú)論作為原核生物的細(xì)菌,還是作為真核生物的酵母、霉菌,都有產(chǎn)氨肽酶的報(bào)道。其中米曲霉(Aspergillusoryzae)是半知菌亞門,絲孢綱,絲孢目,從梗孢科,曲霉屬真菌中的一個(gè)種,在自然界中有廣泛分布。人類很早就開始利用米曲霉進(jìn)行發(fā)酵活動(dòng),它是世界公認(rèn)的安全性生產(chǎn)用菌株。米曲霉產(chǎn)酶種類多,已報(bào)道米曲霉可產(chǎn)多種蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、木聚糖酶、植酸酶等等。米曲霉同時(shí)也是氨肽酶的重要生產(chǎn)菌之一。早在20世紀(jì)70年代,就有日本學(xué)者從米曲霉中分離純化出亮氨酰氨肽酶并進(jìn)行了研究。后來(lái)又陸續(xù)從米曲霉中發(fā)現(xiàn)多種不同的氨肽酶。氨肽酶主要應(yīng)用于食品工業(yè)中。現(xiàn)代食品加工中蛋白質(zhì)的水解是一個(gè)重要課題。蛋白質(zhì)水解后形成多肽和氨基酸,溶解性、營(yíng)養(yǎng)性質(zhì)和口味都會(huì)得到改變,而且更易吸收,提高了蛋白的應(yīng)用范圍。氨肽酶在國(guó)外早已實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn),日本天野公司、Novozymes公司和RhodiaFood公司生產(chǎn)的商品氨肽酶的酶活分別為1200、500和220U/g,因此國(guó)外關(guān)于氨肽酶的發(fā)酵研究相對(duì)較少。而受限于發(fā)酵工業(yè)水平,國(guó)內(nèi)氨肽酶發(fā)酵研究起步較晚,但是發(fā)展較快,其中王俊等使用發(fā)酵控制策略,采用7L發(fā)酵罐,使得1株枯草芽孢桿菌產(chǎn)氨肽酶最高達(dá)到3900U/mL。然而目前國(guó)內(nèi)工業(yè)上仍多使用丹麥Novozymes公司所產(chǎn)的一種蛋白酶和氨肽酶所組成的復(fù)合酶。因此實(shí)現(xiàn)氨肽酶的規(guī)?；a(chǎn),對(duì)于提高我國(guó)的相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平,降低成本具有重要意義。本文主要對(duì)1株米曲霉的氨肽酶發(fā)酵條件進(jìn)行單因子優(yōu)化,提高該菌株氨肽酶產(chǎn)酶水平,為進(jìn)一步優(yōu)化研究提供基礎(chǔ)。1材料和方法1.1病毒本實(shí)驗(yàn)室保存的米曲霉,斜面保藏于4℃冰箱中。1.2冷卻和滅菌PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g洗凈去皮切碎,加水1000mL煮沸0.5h,紗布過濾,冷卻后補(bǔ)水至1000mL,加入葡萄糖20g,瓊脂20g,121℃滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ)):(NH4)2SO42.5g,蛋白胨5g,K2HPO43g,MgSO4·7H2O0.2g,FeSO4·7H2O0.0255g,CaCl20.13g,水1000mL,調(diào)節(jié)pH至5.5。1.3角瓶水面質(zhì)量制備孢子懸液的制備:將菌株劃線接種于含有PDA培養(yǎng)基斜面的茄形瓶中,充分劃線使整個(gè)斜面均有接觸,于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),5d后取出于無(wú)菌室中每瓶加入滅菌的含有0.3%的吐溫80的生理鹽水50mL。用接種環(huán)在斜面上輕輕滑動(dòng)刮下孢子,震蕩后使孢子充分洗下,無(wú)菌紗布過濾裝滅菌后的三角瓶,4℃保存?zhèn)溆?。發(fā)酵培養(yǎng):從孢子懸液瓶中取適量的菌液(2%接種量)到發(fā)酵瓶(裝液量20%)中,并在30℃、200r/min條件下振蕩培養(yǎng),間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定酶活,確定最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制(1)酶活力單位定義:在40℃、pH8.0的條件下,每分鐘水解亮氨酸對(duì)硝基苯胺生成1μg對(duì)硝基苯胺(pNA)所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。(2)酶活力測(cè)定方法:以亮氨酸氨肽酶酶活計(jì),測(cè)定采用亮氨酸對(duì)硝基苯胺法。將亮氨酸對(duì)硝基苯胺溶于無(wú)水乙醇中配成25mmol/L的亮氨酸對(duì)硝基苯胺乙醇溶液,置于4℃冰箱保存。將發(fā)酵液4℃,8000g,離心5min,保留上清粗酶液。將粗酶液稀釋適當(dāng)倍數(shù),分成2份,其中1份沸水浴滅活15min,冷卻至室溫。分別取100μL適當(dāng)稀釋的酶液以及滅活酶液,加入到1.5mLpH為8.0的Tris-HCl緩沖液中,40℃保溫10min使溫度恒定。加入25mmol/L的亮氨酸對(duì)硝基苯胺乙醇溶液100μL,迅速混勻,繼續(xù)水浴10min,立即取出冰浴并于405nm下測(cè)定吸光值。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:配制一系列合適梯度濃度的對(duì)硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,以去離子水為對(duì)照,在405nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度。以對(duì)硝基苯胺濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)(x),對(duì)應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)(y),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下:(4)酶活計(jì)算公式:式中:V1為反應(yīng)總體積;V2為酶液的體積;D為酶液的稀釋倍數(shù);k為消光系數(shù),本實(shí)驗(yàn)中k=0.0341;t為恒溫反應(yīng)時(shí)間。1.5培養(yǎng)基組分單因子的確定(1)碳源種類對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響:向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1%的葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉,并以未添加為對(duì)照,觀察不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響。(2)氮源種類對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響:在前面優(yōu)化的基礎(chǔ)上,分別以0.5%的酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、棉籽殼粉、豆粕作為氮源進(jìn)行單因子試驗(yàn)。(3)氮源濃度對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響:將前一步所選定的氮源:豆粕、黃豆粉分別以1%、2%、3%、4%的比例添加到基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。(4)無(wú)機(jī)鹽對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響:分別去除發(fā)酵培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2,研究其對(duì)產(chǎn)酶有無(wú)影響。(5)初始發(fā)酵pH對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響:調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,篩選合適的初始發(fā)酵pH。(6)豆油及其相關(guān)組成成分對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響:分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2%的豆油、油酸、亞油酸、甘油,篩選需要的添加物。(7)油酸添加量對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶的影響:分別添加濃度為0.1%、0.2%和0.5%油酸,選擇合適的濃度。2結(jié)果與討論2.1最適發(fā)酵時(shí)間確定首先使用原始發(fā)酵培養(yǎng)基,間隔一定時(shí)間取樣測(cè)酶活,確定該米曲霉產(chǎn)氨肽酶的最適發(fā)酵時(shí)間,結(jié)果如圖1所示。由圖可知,一開始隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),該菌產(chǎn)氨肽酶活力逐漸增加,48h時(shí)達(dá)到最大值,然后繼續(xù)培養(yǎng),氨肽酶活力明顯降低,因此在隨后的優(yōu)化試驗(yàn)中,發(fā)酵時(shí)間均為48h。2.2發(fā)酵液中糖代謝規(guī)律碳源是構(gòu)成菌體的碳架及能量的來(lái)源,在真菌的生長(zhǎng)過程中占有很重要的地位。選取葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖、乳糖、淀粉各按照1%的質(zhì)量體積比添加入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基并與不添加碳源的原始基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基做對(duì)比,結(jié)果如圖2所示:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),碳源對(duì)氨肽酶的生產(chǎn)影響很大。添加葡萄糖、半乳糖、木糖、蔗糖以及淀粉的培養(yǎng)基幾乎沒有氨肽酶的生成,而添加乳糖和未額外添加碳源的培養(yǎng)基氨肽酶產(chǎn)量較高。測(cè)定發(fā)酵中pH變化發(fā)現(xiàn)添加葡萄糖,半乳糖,木糖,蔗糖,淀粉的發(fā)酵液pH從5迅速下降,最后達(dá)到2~3之間。而添加乳糖和未添加的發(fā)酵液pH上升,最后穩(wěn)定在7~8之間。因此,當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖等容易利用的物質(zhì)充足時(shí),可能的代謝途徑是葡萄糖或淀粉等其他物質(zhì)直接攝取到菌體內(nèi)進(jìn)行糖酵解,從而限制了蛋白酶的形成。同時(shí)代謝過程中形成的酸性物質(zhì)使發(fā)酵液pH下降。而當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖等物質(zhì)缺乏時(shí),可能的代謝途徑是先將蛋白胨、多肽類物質(zhì)降解成氨基酸。此時(shí)需要較多的蛋白酶。氨基酸在菌體內(nèi)脫氨形成丙酮酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸等物質(zhì),這些物質(zhì)經(jīng)由三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖?最后經(jīng)過糖異生作用轉(zhuǎn)化為糖供菌體利用。由于脫氨基作用形成堿性物質(zhì)導(dǎo)致發(fā)酵液pH上升?？紤]到許多常用碳源對(duì)氨肽酶生產(chǎn)的分解代謝阻遏作用,不再單獨(dú)添加碳源,而是在氮源優(yōu)化中選擇如牛肉膏等營(yíng)養(yǎng)成分種類豐富的物料使其既提供氮源,又為菌體生長(zhǎng)和代謝提供碳源和能源。2.3氮源、以蛋白為原料的米曲霉產(chǎn)氨肽酶的產(chǎn)酶結(jié)果氮源是合成菌體蛋白質(zhì)、核酸等含氮物質(zhì)的重要組成成分。分別添加0.5%的酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、黃豆粉、棉籽殼粉、豆粕,發(fā)酵并檢測(cè)酶活,結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出,氮源對(duì)米曲霉產(chǎn)氨肽酶影響較大,其中牛肉膏、黃豆粉、豆粕都較適合氨肽酶的發(fā)酵,較原始的以蛋白胨為氮源時(shí)產(chǎn)酶活性大大提高。而蛋白含量更高的棉籽殼粉用于發(fā)酵時(shí)單位酶產(chǎn)量較低,可能是由于物料加工處理過于精細(xì),其中缺少了油脂等可能直接或間接促進(jìn)菌株產(chǎn)酶的物質(zhì)。綜合考慮酶活、成本等因素,選擇黃豆粉和豆粕進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。2.4豆豆粉添加量對(duì)發(fā)酵的影響分別加入不同濃度的黃豆粉和豆粕后,結(jié)果如圖4所示,豆粕和黃豆粉在約2%添加量時(shí)產(chǎn)酶效果較好,低于2%添加量時(shí)可能營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不夠充足,酶活相對(duì)較低。而添加量過高時(shí),酶活下降明顯,原因可能是豆粕和黃豆粉不溶性固形物含量較多,如果添加過多,滅菌后培養(yǎng)基呈黏稠粥狀,嚴(yán)重影響了物料傳遞和溶氧,導(dǎo)致菌體產(chǎn)酶下降。而添加2%黃豆粉的培養(yǎng)基產(chǎn)酶水平略優(yōu)于添加2%豆粕的培養(yǎng)基,因此選擇2%黃豆粉作為發(fā)酵用氮源。2.5其他有機(jī)物對(duì)產(chǎn)酶的影響分別去除發(fā)酵培養(yǎng)基中的(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2后發(fā)現(xiàn)其中K2HPO4的去除明顯影響產(chǎn)酶,而其他無(wú)機(jī)鹽的去除對(duì)產(chǎn)酶影響不大(圖5),一方面可能是該菌株氨肽酶生產(chǎn)不過分依賴這些離子,另一方面考慮到該菌株發(fā)酵生產(chǎn)氨肽酶時(shí)蛋白類物質(zhì)依賴性強(qiáng),所添加氮源類物質(zhì)多為黃豆粉、豆粕等,這些物料本身含一定的各類離子,可能足以滿足該菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的需要。因此最后只添加一種無(wú)機(jī)鹽K2HPO4。2.6初始發(fā)酵ph對(duì)發(fā)酵過程的影響微生物的生長(zhǎng)和代謝都有其最適的pH范圍,一般霉菌最適生長(zhǎng)的pH范圍是3~6,有些微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適pH是一致的,但也有許多是不一致的。發(fā)酵過程中,初始pH不但直接影響微生物的生長(zhǎng),還會(huì)影響細(xì)胞膜的電荷狀態(tài),從而影響代謝產(chǎn)物的形成和釋放,以及產(chǎn)物的穩(wěn)定性。有些情況下甚至?xí)绊懩承┥锏暮铣赏緩?。因?對(duì)初始發(fā)酵pH進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果如圖6所示。當(dāng)初始發(fā)酵pH在5.0左右時(shí)酶活力最高,較低或較高的pH均影響氨肽酶的生產(chǎn),故最優(yōu)的發(fā)酵初始pH為5.0。2.7油脂和脂肪酸一些油脂可在微生物自身脂肪酶的作用下分解為甘油和脂肪酸,脂肪酸經(jīng)過β氧化以乙酰輔酶A的形式進(jìn)入代謝循環(huán),起到碳源的作用。當(dāng)以植物油作為碳源進(jìn)行發(fā)酵時(shí),由于油是疏水性的,因而在發(fā)酵液中濃度低,這可有效地避免分解代謝物的阻遏作用,有利于次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。同時(shí),一定量的油脂可以作為氧的載體增加發(fā)酵液氧的傳遞速率。另外油脂本身可起到一定的表面活性劑作用,以大豆油脂為例,其中含有少量磷脂、非水化磷脂和甘一酯、甘二酯等表面活性成分。這些也可能對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生影響。所以目前油脂在發(fā)酵生產(chǎn),尤其是抗生素發(fā)酵中得到了一定的應(yīng)用。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2%的豆油或其相關(guān)組成成分后結(jié)果如圖7所示,與原培養(yǎng)基相比,添加油酸、亞油酸、豆油之后產(chǎn)酶均有所增加,可能是菌體緩慢利用了油脂和脂肪酸進(jìn)行代謝。而甘油由于和水可以以任意比例混溶導(dǎo)致菌體利用迅速,產(chǎn)生了分解代謝物阻遏現(xiàn)象,所以產(chǎn)酶能力下降。2.8油酸添加量的確定最后,向培養(yǎng)基中添加不同含量的油酸以觀察最佳添加濃度,如圖8所示,確定了0.2%油酸為較佳添加量,過多油酸抑制了菌體產(chǎn)酶,較高濃度效果不佳的原因可能是過多不溶性的油酸懸浮于發(fā)酵液液面,影響了溶氧。3發(fā)酵條件篩選試驗(yàn)結(jié)果表明,該米曲霉