第八章 親和純化技術(shù)

親和純化親和純化技術(shù)利用生物分子間的特異性結(jié)合作用的原理進行生物物質(zhì)分離純化的技術(shù)稱為親和純化技術(shù)（Affinitypurification）23技術(shù)要點（1）找與底物專一可逆結(jié)合的配基；（2）將配基通過共價鍵偶聯(lián)到基質(zhì)；（3）配基與底物吸附；（4）洗脫目標物。

4親和純化技術(shù)親和層析(Affinitychromatography)親和過濾（膜分離）親和分配（雙水相萃?。┯H和反膠團萃取（反膠團萃?。┯H和沉淀（沉淀）親和電泳（電泳）5第一節(jié)親和層析

(affinityChromatography)利用生物大分子物質(zhì)具有與某些相應(yīng)的分子專一性可逆結(jié)合的特性而建立的層析技術(shù)。

適用于從成份復雜且雜質(zhì)含量遠大于目標物的混合物中提純目標物。6特點經(jīng)過一次處理可得到高純度活性物質(zhì)；設(shè)備要求不高、操作簡便、特異性強、分離速度快、分離效果好、分離條件溫和；親和吸附劑通用性較差，專用的吸附劑。7親和吸附劑：載體—配基在親和層析中起可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)稱為配基（Ligand）。與配基結(jié)合的層析介質(zhì)稱為載體（Matrix）。8一、親和層析的原理（1）配基固定化：配基與載體偶聯(lián)，結(jié)合成具有特異親和性的分離介質(zhì)。（2）吸附樣品：親和層析介質(zhì)選擇性吸附生物活性物質(zhì).（3）樣品解吸：選擇適宜的條件使被吸附物活性物質(zhì)解吸。9二、親和層析載體（一）、親和層析對載體的要求：（1）充分功能化，與配基進行共價連接。（2）有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性。（3）具有高度的水不溶性和親水性。（4）具有多孔的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。（5）應(yīng)為大小均勻的剛性小球。10（二）、常用載體

纖維素

(cellulose)瓊脂糖凝膠

葡聚糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠

多孔玻璃珠（Bio-Glass）

其它載體——殼聚糖

(Chitosan)111、纖維素纖維素結(jié)構(gòu)緊密、均一性差，不利于大分子的滲入。非特異性吸附力較強，空間位阻。主要用于分離與核酸有關(guān)的物質(zhì)。

122、瓊脂糖凝膠瓊脂糖濃度有2%、4%、6%，商品為Sepharose2B、4B和6B（Pharmacia）。保持吸附物質(zhì)活性，能迅速活化并接上各種功能基團，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快。SepharoseCL,穩(wěn)定性明顯增加，能在pH3~14中應(yīng)用。

13

3、葡聚糖凝膠：葡聚糖凝膠孔徑太小，偶聯(lián)配基后，孔徑更小，應(yīng)用受到限制。

4、聚丙烯酰胺凝膠：Bio-gelP

有供化學反應(yīng)的酰胺基，能制得配基含量較高的親和柱，適用于親和勢比較低的系統(tǒng)。

pH過高或過低的溶液中酰胺基易水解。14

5、多孔玻璃珠：化學與物理穩(wěn)定性較好，機械強度高。缺點：親水性不強，對蛋白質(zhì)尤其是堿性蛋白質(zhì)有非特異性吸附，化學活性基團少。6、其它載體——殼聚糖15殼聚糖(甲殼素和殼聚糖)16三、親和配基

配基的選擇配基的濃度配基偶聯(lián)的位置配基分子的大小配基的類型17（一）、配基的選擇

親和層析配基的選用主要取決于分離對象。

1、配基與配體有足夠大的親和力（親和勢），KL

在10-4～10-8之間。

2、配基與配體的結(jié)合應(yīng)是專一的。3、配基應(yīng)具有化學活性。18親和勢—KL（EL復合物的解離常數(shù)）

19（二）、配基的濃度

對親和勢比較低的時候（KL≥10-4mol/L），增加配基濃度有利于吸附。增加親和柱的長度來提高吸附率。配基濃度太高使吸附力太強，洗脫困難。理想的配基濃度為1-10μmol/L。20（三）、配基偶聯(lián)的位置配基固定化時，其不參與親和結(jié)合的部位與載體進行偶聯(lián)。AMP-Sepharose親和柱腺嘌呤N6-氨基接到載體上，對脫氫酶和甘油激酶有吸附力。磷酸基接到載體上，對甘油醛-3-磷酸脫氫酶有吸附力。21（四）、配基分子的大小選用大分子配基。甘氨酸小分子物質(zhì)作為配基，載體和配基間插入一個“手臂”以消除空間障礙。22（五）、配基的類型

較小的有機分子或天然生物活性物質(zhì)。根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì):特殊配基和通用配基。特殊配基（specialligand）

23通用配基（generalligand）用于一類物質(zhì)的分離提純。用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配基；用ATP作激酶類親和層析的通用配基；用外源性凝集素作糖蛋白類親和層析時的通用配基等。

24四、

載體的活化與偶聯(lián)

糖類載體的活化與偶聯(lián)

聚丙烯酰胺凝膠及其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)用于固定化配基的凝膠衍生物

25（一）、糖類載體活化與偶聯(lián)

溴化氰活化法高碘酸氧化法環(huán)氧化法甲苯磺酰氯法雙功能試劑法26（二）、聚丙烯酰胺凝膠及

其它凝膠衍生物活化與偶聯(lián)疊氮化法重氮化法(含氨基載體)碳二亞胺縮合法（含羧基載體）27五、

影響吸附親和力的幾個因素

KL配基濃度對親和力的影響空間障礙的影響配基與載體的結(jié)合位點的影響載體孔徑的影響微環(huán)境的影響28（一）、配基濃度對親和力的影響為將親和配體與其它物質(zhì)分開，需要阻留值≥10。配基濃度與親和對解離常數(shù)相關(guān)。對于低親和力系統(tǒng)，配基濃度。

29（二）、空間障礙的影響空間位阻。對于分子大的配體以及小分子配基更明顯。“手臂”，增加與載體相連配基的活動度，減輕載體的立體障礙。常用的“手臂”多為烴鏈。

30（三）、配基與載體的結(jié)合位點的影響多肽或蛋白質(zhì)等大分子配基須控制偶聯(lián)反應(yīng)條件，使它以最少的功能基團與載體連接。保持蛋白質(zhì)原有的高級結(jié)構(gòu)，使親和吸附劑具有較大的親和力。

31（四）、載體孔徑的影響載體孔隙是配體向配基接近的通道?？讖酱笮ξ絼┯H和能力有影響。（五）、微環(huán)境的影響載體及“手臂”的電性、極性對親和力的影響。避免引入離子鍵的基團。疏水作用的存在，會引起非特異性吸附作用。32六、

配基與間隔臂的連接

（一）、含氮配基的連接（二）、含羧基配基的連接（三）、含巰基配基的連接（四）、含醛基、酮基、羥基配基的連接33七、

親和層析的吸附和洗脫

影響吸附的條件親和層析的洗脫親和吸附劑的再生34（一）、影響吸附的條件

親和吸附劑及配體的性質(zhì)緩沖液的種類、離子強度、pH、溫度和層析流速有關(guān)。溫度升高會使吸附作用減弱。流速每小時低于10ml/cm2。層析柱用前必須充分平衡。上樣體積為柱床體積的5%。35非專一性吸附

親和層析中的非專一性吸附。離子效應(yīng)疏水基團復合親和力36離子效應(yīng)

配基與載體-間隔臂的不完全結(jié)合，將無關(guān)離子基團引入吸附劑。具有離子基團的親和吸附劑會影響蛋白質(zhì)的洗脫行為。37疏水基團吸附劑疏水性基團與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的疏水區(qū)相互吸引，形成非專一性吸附。疏水基團：（1）長的烴鏈結(jié)構(gòu)的“手臂”：（2）疏水性配基：38復合親和力離子效應(yīng)作用，又有疏水作用。配體與配基有較強生物特異性。用高濃度的鹽和有機溶劑，以提高選擇性。39（二）、親和層析的洗脫洗脫：洗脫方法主要有三種：非專一性洗脫特殊洗脫專一性洗脫40非專一性洗脫

改變洗脫劑的pH。離子強度的分步和梯度變化.親和勢很高，促溶離子，其洗脫能力的強弱順序Cl－<I－<CF3COO－<SCN－

<CCl3COO－。用蛋白質(zhì)變性劑（如脲或鹽酸胍）。41特殊洗脫裂解配基與載體的連接鍵。斷裂方法有：硫酯鍵用羥胺處理30分鐘；偶氮鍵用連二亞硫酸鈉硼酸緩沖液處理；二硫鍵用巰基乙醇、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等處理。42專一性洗脫S（固定化配基），E（酶），I（游離配基）（1）競爭性效應(yīng)，即ESI不如EI穩(wěn)定，增加洗脫劑中I，會使E洗脫下來（正洗脫）。（2）當ESI穩(wěn)定性與