第六章 植物細(xì)胞制藥

第六章植物細(xì)胞工程制藥第一節(jié)概述人們利用植物作為藥物已有幾千年的歷史了，尤其是我國(guó)對(duì)中草藥的應(yīng)用。高等植物的次生代謝產(chǎn)物豐富多樣，應(yīng)用范圍廣。植物代謝產(chǎn)物多為混合物，其比例很關(guān)鍵。植物是活性化合物的最豐富的來(lái)源。通過植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)可以解決植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、代謝成分復(fù)雜等問題，以獲得大量活性物質(zhì)。植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)天然藥物并實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵是提高單位培養(yǎng)基中目的物質(zhì)的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本，包括改進(jìn)培養(yǎng)條件、篩選高產(chǎn)細(xì)胞株、研制適合于植物細(xì)胞大量培養(yǎng)的新型生物反應(yīng)器。一、植物細(xì)胞工程技術(shù)及應(yīng)用

植物細(xì)胞工程：是指以植物細(xì)胞為基本單位，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論和技術(shù)，在離體條件下進(jìn)行培養(yǎng)、增殖，使細(xì)胞的某些生物學(xué)特性按照人們的意愿發(fā)生改造，從而改良品種、制造新品種、加速繁育植物個(gè)體或獲得有用物質(zhì)的一門科學(xué)或技術(shù)。植物細(xì)胞工程主要由兩部分構(gòu)成：上游工程，包含細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞遺傳操作和細(xì)胞保藏三個(gè)步驟。下游工程，將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中，生產(chǎn)生物產(chǎn)品的過程。其中細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞工程的技術(shù)基礎(chǔ)。1、植物細(xì)胞工程技術(shù)（1）快速繁殖技術(shù)

通過植物體細(xì)胞胚胎再生成一完整植株。這種技術(shù)主要用于花卉、樹木、蔬菜、果樹、中草藥和農(nóng)作物的快速繁殖。（2）誘導(dǎo)增加或減少植物體內(nèi)染色體組數(shù)的技術(shù)

有些植株的染色體比正常細(xì)胞少一半（單倍體），而有些經(jīng)誘導(dǎo)后染色體加倍（多倍體）。單倍體有利于植物品種的改良；多倍體產(chǎn)量高，為不同倍性植物間的雜交提供了遺傳保證。（3）體細(xì)胞雜交技術(shù)

利用自然或人工方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合成一個(gè)細(xì)胞，形成體細(xì)胞雜種。（4）植物細(xì)胞生產(chǎn)應(yīng)用技術(shù)

利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，提供植物細(xì)胞最適宜的生活環(huán)境，進(jìn)行無(wú)性繁殖，大量地培養(yǎng)成植株，解決天然資源的不足。2、植物細(xì)胞工程的應(yīng)用（1）細(xì)胞育種誘導(dǎo)突變，篩選新品系、新品種。（2）次級(jí)代謝產(chǎn)物生成從培養(yǎng)的植物細(xì)胞中提取所需的代謝產(chǎn)物。優(yōu)點(diǎn)：比栽培原料作物更易控制最佳生產(chǎn)條件；培養(yǎng)物為無(wú)菌材料，能保證產(chǎn)品質(zhì)量；工藝操作較為簡(jiǎn)單，可減少成本，提高生產(chǎn)率。3、植物細(xì)胞工程生產(chǎn)的藥物目前，已經(jīng)從400多種植物中分離出細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)，獲得600多種所需的化合物，其中有60多種在含量上超過或趨于原植物，包括色素、固醇、生物堿、維生素、激素、多糖、植物殺蟲劑及生長(zhǎng)素等數(shù)十類。已有紫杉醇、紫草素、迷迭香酸和人參皂苷等產(chǎn)品進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)階段。二、植物細(xì)胞工程發(fā)展簡(jiǎn)史

19世紀(jì)上半葉，提出了細(xì)胞學(xué)說(shuō)。20世紀(jì)初葉，德國(guó)著名植物學(xué)家依據(jù)細(xì)胞理論，首次提出了高等植物的器官和組織可以不斷分割，直至單個(gè)細(xì)胞。20世紀(jì)20年代初至30年代，胚胎培養(yǎng)和器官培養(yǎng)取得了一些成果。

30年代末至40年代，研究工作主要集中在植物細(xì)胞器官與營(yíng)養(yǎng)需求之間的關(guān)系。40年代末至50年代，植物組織培養(yǎng)取得新進(jìn)展，確定了腺嘌呤和生長(zhǎng)素的比例是控制芽和根形成的主要條件之一。

60年代初，分離出植物的原生質(zhì)體。

60至70年代中葉，主要工作是開發(fā)培養(yǎng)基和研究培養(yǎng)方法。

1975-1985年主要進(jìn)行優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)和次級(jí)代謝產(chǎn)物形成的研究。最近10年應(yīng)用分子生物學(xué)，取得紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌新藥紫杉醇成果?，F(xiàn)在已經(jīng)具備在２萬(wàn)升規(guī)模的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)煙草細(xì)胞的能力。日本的三井石化使用750L發(fā)酵罐通過培養(yǎng)植物細(xì)胞生產(chǎn)紫草寧，產(chǎn)量較高，可滿足全日本百分之四十以上的需要。三、相關(guān)概念1、植物組織培養(yǎng)在無(wú)菌條件下，對(duì)離體植物組織（器官或細(xì)胞）分離并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使其能夠繼續(xù)生長(zhǎng)，甚至分化發(fā)育成一完整的植株的一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前已發(fā)展出愈傷組織培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)等類型的植物組織培養(yǎng)。2、植物細(xì)胞的全能性即植物體的每個(gè)細(xì)胞攜帶著一套完整的基因組，故具有發(fā)育成完整植株的潛在能力。

組織培養(yǎng)的理論依據(jù)是植物細(xì)胞的全能性。植物組織體內(nèi)原本已經(jīng)分化的細(xì)胞，一旦脫離原有的機(jī)體環(huán)境，成為離體狀態(tài)，在適宜的營(yíng)養(yǎng)和外界條件下，就會(huì)表現(xiàn)出全能性，從已經(jīng)分化定型的細(xì)胞，脫分化，成為恢復(fù)分裂能力的細(xì)胞，并能重新生長(zhǎng)發(fā)育成完整的植株。3、愈傷組織

愈傷組織是指一個(gè)離體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)胞，通過脫分化不斷分裂、增生子細(xì)胞，這些細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明，逐漸形成無(wú)序結(jié)構(gòu)的一團(tuán)細(xì)胞。4、懸浮培養(yǎng)在愈傷組織培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種培養(yǎng)技術(shù)。以能夠保持較好分散性的離體細(xì)胞或較小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。5、細(xì)胞培養(yǎng)

利用單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行液體或固體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其增殖及分化。目的是為了得到單細(xì)胞無(wú)性繁殖系。6、分生組織培養(yǎng)

又稱生長(zhǎng)錐培養(yǎng)，在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細(xì)胞。

7、器官培養(yǎng)指植物根、莖尖、葉、花器官各部分原基或未成熟的花器官各部分以及未成熟小果實(shí)的無(wú)菌培養(yǎng)。8、胚胎培養(yǎng)對(duì)植物的胚(種胚)及胚器官(如子房,胚珠)進(jìn)行人工離體無(wú)菌培養(yǎng)，使其發(fā)育成幼苗的技術(shù)。

9、外植體從植物體上分離下來(lái)的用于離體培養(yǎng)的材料（器官或組織）。植物的個(gè)部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。

10、器官形成一般指在組織培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)物中芽、根或花等器官的分化與形成。11、無(wú)性繁殖

又叫克隆，指使用母體培養(yǎng)物反復(fù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)時(shí)，通過同種外植體而獲得越來(lái)越多的無(wú)性繁殖后代。

12、突變體

細(xì)胞本身發(fā)生遺傳變異或應(yīng)用誘變處理發(fā)生的遺傳變異所得的新細(xì)胞。

13、繼代培養(yǎng)

由最初的外植體上切下的新增殖的組織，培養(yǎng)一代稱為“第一代培養(yǎng)”，連續(xù)多代的培養(yǎng)就稱為繼代培養(yǎng)。14、次級(jí)代謝作用和次級(jí)代謝產(chǎn)物

除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白質(zhì)及糖類以外，具有如下特征的成分為次級(jí)代謝產(chǎn)物：有明顯的分類學(xué)區(qū)域界限；其合成需在一定的條件下才能發(fā)生；缺乏明確的生理功能；是生命的多余成分。

次級(jí)代謝作用是特殊蛋白質(zhì)內(nèi)源化合物的合成、代謝及分解作用的綜合體現(xiàn)。生物堿、黃酮體、萜類、有機(jī)酸、木質(zhì)素等。第二節(jié)植物細(xì)胞的形態(tài)及生理特性一、植物細(xì)胞的形態(tài)單細(xì)胞植物，藻類；多細(xì)胞植物其細(xì)胞形態(tài)多種多樣，球形、類圓形、橢圓形、角形；具有支持作用的細(xì)胞的細(xì)胞壁常增厚，類圓形、紡錘形；具有輸導(dǎo)作用的細(xì)胞呈管形。

細(xì)胞大小不一，基本組織細(xì)胞體積較大，直徑在20-100微米之間；儲(chǔ)藏組織細(xì)胞的直徑可達(dá)1毫米；最長(zhǎng)的細(xì)胞是無(wú)節(jié)乳管，長(zhǎng)達(dá)數(shù)米至數(shù)十米。二、植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征高等植物為真核生物，在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞壁、細(xì)胞核和液泡以及細(xì)胞內(nèi)一些較大的結(jié)構(gòu)容易辨認(rèn)。植物細(xì)胞由細(xì)胞壁和原生質(zhì)體組成，原生質(zhì)體包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和液泡。與動(dòng)物細(xì)胞相比植物細(xì)胞有三個(gè)特點(diǎn)，即具有細(xì)胞壁、液泡和質(zhì)體（葉綠體）。三、細(xì)胞后含物和生理活性物質(zhì)

細(xì)胞中除含有生命物質(zhì)原生質(zhì)體外，還有許多非生命物質(zhì)（亦稱后含物）。細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，一類是后含物，是儲(chǔ)藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)，如糖類、鹽類、生物堿、糖苷類、有機(jī)酸、揮發(fā)油等；另一類是生理活性物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生化代謝和生理活動(dòng)起著調(diào)節(jié)作用，如酶、維生素、植物激素、植物殺菌素等。1、細(xì)胞后含物（1）生物堿：含氮有機(jī)化合物，中藥含有多種生物堿，如麻黃堿、咖啡因、阿托品、奎寧、黃連素等。（2）糖苷類：某些有機(jī)化合物和糖經(jīng)糖苷鍵結(jié)合而成，對(duì)疾病有很好的治療作用。（3）揮發(fā)油：具有芳香氣味，如薄荷油、丁香油和桉油等。（4）有機(jī)酸：糖類代謝的中間產(chǎn)物，如蘋果酸、檸檬酸、水楊酸、酒石酸等。2、生理活性物質(zhì)

對(duì)細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)和生理活動(dòng)起調(diào)節(jié)作用。

（1）酶類：生物催化劑；

（2）維生素：參與酶的形成，對(duì)植物生長(zhǎng)、呼吸、物質(zhì)代謝有調(diào)節(jié)作用；

（3）植物激素：調(diào)節(jié)代謝；

（4）抗生素和植物殺菌素：殺死和抑制某些微生物生長(zhǎng)的物質(zhì)。四、植物培養(yǎng)細(xì)胞的生理特性植物培養(yǎng)細(xì)胞不同生長(zhǎng)階段的持續(xù)時(shí)間及特征（表）生長(zhǎng)階段持續(xù)時(shí)間特征延遲期分裂的初始期取決于培養(yǎng)前的細(xì)胞數(shù)恒定，RNA含量高，和最大生長(zhǎng)期條件、時(shí)間和培蛋白質(zhì)合成強(qiáng)，有絲分裂之間養(yǎng)基性質(zhì)加速，細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部分增加。加速期細(xì)胞最大生長(zhǎng)期3-4代細(xì)胞數(shù)、DNA、蛋白質(zhì)濃度和最大細(xì)胞濃度增加，有絲分裂活性、RNA最佳DNA和蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)合成能力降累積率。

低。對(duì)數(shù)期介于最大生長(zhǎng)率蛋白質(zhì)合成能力完全減退和蛋白質(zhì)合成完多聚核糖體解離。全停止期之間

穩(wěn)定期細(xì)胞數(shù)穩(wěn)定細(xì)胞高液泡化、極度脆弱、有機(jī)化合物濃度高（1）植物細(xì)胞重量的增加主要在對(duì)數(shù)期，而次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積主要在穩(wěn)定期。（2）植物細(xì)胞多以非均相集合體的細(xì)胞團(tuán)形式存在，細(xì)胞團(tuán)產(chǎn)生的原因有：①細(xì)胞分裂之后沒有進(jìn)行細(xì)胞分離；②在間歇培養(yǎng)過程中，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期時(shí)，開始分泌粘多糖和蛋白質(zhì)，或以其他方式形成粘性表面，從而形成細(xì)胞團(tuán)。（3）細(xì)胞外骨架相當(dāng)脆弱，表現(xiàn)為抗張力強(qiáng)度大，抗剪切力能力小，要采用合適的攪拌。（4）所有植物細(xì)胞都是好氣性的，培養(yǎng)需通氣，但不需要很高的氣液傳質(zhì)速率，而是要控制供氧量，以保持較低的溶氧水平。（5）泡沫性質(zhì)不同于微生物發(fā)酵，氣泡大，黏度也大，通常要采用化學(xué)或機(jī)械方法加以控制。（6）培養(yǎng)過程中可能會(huì)黏附于反應(yīng)器壁、電極或擋板的表面上。第三節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥物的基本過程：材料準(zhǔn)備（外植體的選擇、培養(yǎng)條件選擇）

誘導(dǎo)分化愈傷組織繼代培養(yǎng)（優(yōu)良細(xì)胞系篩選、建立）

規(guī)?；a(chǎn)培養(yǎng)

產(chǎn)品提取、分離純化一、材料的準(zhǔn)備

1、外植體的選擇與高產(chǎn)細(xì)胞株的建立適宜于工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞株，應(yīng)達(dá)到下列基本條件：分散性好，適于工業(yè)化生產(chǎn)；細(xì)胞形態(tài)均一性好，甚至在生理生化狀態(tài)上同步；生長(zhǎng)迅速；細(xì)胞中次生產(chǎn)物含量高；細(xì)胞生長(zhǎng)和次生產(chǎn)物合成能力穩(wěn)定。（1）外植體的選擇選擇次生代謝產(chǎn)物含量較高的原植物為外植體；天然產(chǎn)物一般為次級(jí)代謝產(chǎn)物，在起始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)盡量選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織為外植體。同時(shí)，考慮同一植物不同部位外植體的分化能力、分化條件及分化類型。（2）高產(chǎn)細(xì)胞株的建立以愈傷組織作為規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)源，在外植體選定后，首先要誘導(dǎo)愈傷組織，在外植體誘導(dǎo)出愈傷組織后，篩選生長(zhǎng)快、次級(jí)代謝產(chǎn)物合成能力強(qiáng)的細(xì)胞系。篩選高產(chǎn)細(xì)胞系的方法：直接篩選法和誘變篩選法。高產(chǎn)細(xì)胞系建立的方法：①?gòu)V泛采集屬內(nèi)或科內(nèi)不同種、不同年齡、不同地區(qū)、不同器官的高含量親本株的外植體誘導(dǎo)新的愈傷組織，建立新的無(wú)性細(xì)胞系；②建立直板法及細(xì)胞團(tuán)塊法從細(xì)胞系中快速分離篩選高產(chǎn)細(xì)胞株；③采用特定培養(yǎng)基進(jìn)行定向富集篩選，獲得激素自養(yǎng)型及耐受高劑量細(xì)胞毒化劑的馴化系；④對(duì)細(xì)胞繼代穩(wěn)定性進(jìn)行研究，建立有利于高產(chǎn)細(xì)胞株種質(zhì)穩(wěn)定的繼代培養(yǎng)方法。（3）外植體處理用于植物組織培養(yǎng)的外植體，必須無(wú)菌材料。外植體如果含有其他微生物，要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌，以免在培養(yǎng)基中微生物大量迅速繁殖而影響植物組織的培養(yǎng)。常用表面滅菌試劑，其特點(diǎn)是滅菌后易于除去或容易分解。根據(jù)所處理材料對(duì)滅菌試劑的敏感性選擇適當(dāng)?shù)奶幚頃r(shí)間。常用滅菌試劑有次氯酸鈣、次氯酸鈉和氯化汞。次氯酸鈣為工業(yè)漂白粉過濾后的飽和溶液，適用于草本植物和柔軟組織的滅菌處理，時(shí)間為5-30min。氯化汞滅菌效果好，但不易除去，時(shí)間不易過長(zhǎng)，以免殺死植物細(xì)胞。其用于休眠種子的滅菌劑最為理想，適用濃度為0.1%，2-10min，種子皮較厚時(shí)可延長(zhǎng)至20min以上。

2、培養(yǎng)基及其組成

培養(yǎng)基是植物離體器官、組織或細(xì)胞等的無(wú)菌土壤，營(yíng)養(yǎng)成分可調(diào)控。

植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)基常含有無(wú)機(jī)鹽、碳源、有機(jī)氮源、植物生長(zhǎng)激素、維生素等成分。應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的離子平衡溶液。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。硝酸鹽(鉀、銨)的含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。B5培養(yǎng)基1968年由Gamborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，從實(shí)踐中得知，有些植物在B5培養(yǎng)基生長(zhǎng)更適宜：如雙子葉植物特別是禾本植物。white培養(yǎng)基1934年white為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的，1963年又作了改良。本培養(yǎng)基的特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽數(shù)量較低，適于生根培養(yǎng)。KM-8P培養(yǎng)基1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。其特點(diǎn)是有機(jī)成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素、呼吸代謝中的主要有機(jī)酸。廣泛應(yīng)用于原生質(zhì)體和融合體的培養(yǎng)。LS培養(yǎng)基與MS基本成分較為接近，LS培養(yǎng)基去掉了甘氨酸、鹽酸吡哆醇和煙酸。

（1）無(wú)機(jī)鹽

基本培養(yǎng)基是由各種濃度的無(wú)機(jī)鹽溶液組成。無(wú)機(jī)鹽又分為大量元素和微量元素。大量元素是指使用濃度大于30mg/L的無(wú)機(jī)元素，有氮、硫、磷、鉀、鎂、鈣、氯、鈉。微量元素是指使用濃度低于30mg/L的無(wú)機(jī)元素，如鐵、錳、碘、鉬、銅、鋅等。磷的消耗很快，但機(jī)體自身可產(chǎn)生磷可滿足需要；氮常以銨鹽或硝酸鹽形式提供。鉀、鎂、鈣離子對(duì)細(xì)胞代謝必不可少，鎂離子參與多種輔酶和激活子的合成；鉀離子、鈣離子可抑制某些酶的活性，有時(shí)鈣離子也可保持某些酶的活性或穩(wěn)定性。微量元素的作用是參與輔因子的形成，并可誘導(dǎo)酶的合成。

（2）碳源

植物細(xì)胞培養(yǎng)物通常為異養(yǎng)細(xì)胞，常用的碳源為碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖和半乳糖等。天然提取物（如椰子乳）對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)也有重要意義。（3）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑植物激素是植物代謝過程中形成的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，在極低濃度（小于1μmol/L）時(shí)，即能調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育過程，并能從合成部位轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位而發(fā)揮作用。常見的5種植物激素：生長(zhǎng)素、分裂素、赤霉素、脫落酸、乙烯。愈傷組織或培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存依賴于合成的生長(zhǎng)素或天然生長(zhǎng)素，生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)特異酶類。植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)過程主要取決于生長(zhǎng)素和分裂素的比例，比值高可刺激細(xì)胞分裂；比值低則刺激細(xì)胞生長(zhǎng)。對(duì)于植物培養(yǎng)細(xì)胞，絕大多數(shù)培養(yǎng)基中都必須加入一定量的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。

（4）有機(jī)氮源

常用蛋白質(zhì)水解物或各種氨基酸。有機(jī)氮源對(duì)細(xì)胞的早期生長(zhǎng)有利，氨基酸的加入是為了代替或增加氮源的供應(yīng)。

（5）維生素

植物細(xì)胞通常是維生素自養(yǎng)型，但大多數(shù)情況下，其合成的量不能滿足需要，需加入B族維生素，以及生物素和肌醇。

二、培養(yǎng)方法按培養(yǎng)對(duì)象：原生質(zhì)體培養(yǎng)和單倍體細(xì)胞培養(yǎng)；按培養(yǎng)基類型：固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；按培養(yǎng)方式：懸浮培養(yǎng)和固定化細(xì)胞培養(yǎng)。固體培養(yǎng)包括瓊脂培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便易行、所占空間小。缺點(diǎn)：①外植體或愈傷組織僅有一部分與培養(yǎng)基接觸，培養(yǎng)基中產(chǎn)生濃度差，愈傷組織生長(zhǎng)不平衡；②外植體基部插入培養(yǎng)基中，該處氣體交換不暢，阻礙了組織呼吸正常進(jìn)行，會(huì)堆積生長(zhǎng)過程中的有害物質(zhì)；③在愈傷組織細(xì)胞間出現(xiàn)極化現(xiàn)象，導(dǎo)致細(xì)胞群體不均一；④固體培養(yǎng)物有時(shí)要測(cè)定一些生理生化指標(biāo)，還需轉(zhuǎn)入液體。植物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度為25℃左右，常需光照，光照以每天16h為宜，一般用日光燈照射。由于植物組織在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)要不斷消耗養(yǎng)分、散失水分和累積代謝產(chǎn)物，因此外植體在培養(yǎng)3周左右必須移至新鮮培養(yǎng)基上，以保持繼續(xù)生長(zhǎng)。移換一次培養(yǎng)基成為一次繼代培養(yǎng)，經(jīng)過一定次數(shù)的繼代培養(yǎng)，其培養(yǎng)物可用于懸浮培養(yǎng)。液體培養(yǎng)系統(tǒng)包括小規(guī)模的懸浮培養(yǎng)和大規(guī)模的成批培養(yǎng)、半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)有靜止培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)兩類。1、成批培養(yǎng)法

將培養(yǎng)基一次性加入反應(yīng)器中，接種、培養(yǎng)一定時(shí)間后收獲細(xì)胞的操作方式。最適于植物細(xì)胞培養(yǎng)的是氣升式反應(yīng)器。根據(jù)次級(jí)代謝產(chǎn)物的大量積累一般發(fā)生在細(xì)胞生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，植物細(xì)胞采用兩步培養(yǎng)法，使用兩個(gè)反應(yīng)器：第一個(gè)用于細(xì)胞生物量的累積，第二個(gè)用于次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。2、半連續(xù)培養(yǎng)法

在反應(yīng)器中投料和接種培養(yǎng)一段時(shí)間后，將部分培養(yǎng)液和新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行交換的培養(yǎng)方法。

3、連續(xù)培養(yǎng)法

利用連續(xù)培養(yǎng)反應(yīng)器，在投料和接種一段時(shí)間后，以一定的速度連續(xù)采集細(xì)胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境維持恒定的方法。4、固定化培養(yǎng)法

固定化反應(yīng)器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中空纖維膜等多種類型。將細(xì)胞固定在尼龍網(wǎng)套內(nèi)或固定于中空纖維膜反應(yīng)器的膜表面，或固定于網(wǎng)狀多孔板上，放入培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，或連續(xù)通入新鮮培養(yǎng)基，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)及連續(xù)收集細(xì)胞；也可通入凈化空氣代替攪拌。固定化的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞位置固定，易于獲得高密度細(xì)胞群體和維持細(xì)胞間的物理化學(xué)梯度，利于細(xì)胞組織化，易于控制培養(yǎng)條件及獲得次級(jí)代謝產(chǎn)物。三、影響植物次級(jí)代謝產(chǎn)物累積的因素影響次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累積的因素主要有：①生物條件：外植體、季節(jié)、休眠、分化等；②物理?xiàng)l件：溫度、光（光照時(shí)間、光強(qiáng)、光質(zhì)）、通氣（氧氣）、pH和滲透壓；③化學(xué)條件：無(wú)機(jī)鹽、碳源、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、維生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物質(zhì)和前體等；④工業(yè)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)罐類型、通氣、攪拌和培養(yǎng)方式等。1、外植體的選擇

不同外植體的懸浮培養(yǎng)物，其最大次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累時(shí)間不同。同一化合物可以在不同外植體的不同生長(zhǎng)階段累積。

2、培養(yǎng)條件的影響

培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素：營(yíng)養(yǎng)成分、生物及非生物元素、pH、通氣以混合程度、與接種有關(guān)的因素。外部因素：剪切力、攪拌頻率、溫度和光等。（1）培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素

①接種和誘導(dǎo)

外植體的大小直接影響所誘導(dǎo)的組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且也關(guān)系到其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力。外植體的前處理也可嚴(yán)重影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積方式。②培養(yǎng)基的組成基本培養(yǎng)基的各種成分是愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。磷：低磷會(huì)導(dǎo)致次級(jí)代謝產(chǎn)物的累積，缺乏磷會(huì)導(dǎo)致生物量的大幅度降低。氮：有些植物可利用硝酸鹽作為第一氮源；有些則利用銨鹽作為第一氮源；有些需要兩種氮源；有的需要特殊的有機(jī)氮源。如天冬氨酸