第二章5基因工程-重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞

第三部分重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞一、受體細(xì)胞二、選擇受體細(xì)胞的基本原則三、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法1、轉(zhuǎn)化概念轉(zhuǎn)化

：DNA重組分子在體外構(gòu)建完成后，必須導(dǎo)入特定的受體細(xì)胞，使之無性繁殖并高效表達(dá)外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導(dǎo)入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化（Transformation）。重組DNA人工導(dǎo)入受體細(xì)胞有許多方法，包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、接合以及其它物理手段，如受體細(xì)胞的電穿孔和顯微注射等，這些導(dǎo)入方法在DNA重組技術(shù)中統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)化操作。一、重組DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段而實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種特殊生理狀態(tài)。處于感受態(tài)的受體細(xì)菌，其吸收轉(zhuǎn)化因子的能力為一般細(xì)菌生理狀態(tài)的千倍以上，而且不同細(xì)菌間的感受態(tài)差異往往受自身的遺傳特性、菌齡、生理培養(yǎng)條件等諸多因素的影響。2、細(xì)菌轉(zhuǎn)化的步驟：感受態(tài)的形成。感受態(tài)時細(xì)胞表面出現(xiàn)各種蛋白質(zhì)和酶類，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合、切割及加工。感受態(tài)細(xì)胞能分泌一種小分子量的激活蛋白或感受因子，其功能是與細(xì)胞表面受體結(jié)合，誘導(dǎo)某些與感受態(tài)有關(guān)的特征性蛋白質(zhì)（如細(xì)菌溶素）的合成，使細(xì)菌胞壁部分溶解，局部暴露出細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白和核酸酶等。轉(zhuǎn)化因子的結(jié)合。受體菌細(xì)胞膜上的DNA結(jié)合蛋白可與轉(zhuǎn)化因子的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，單鏈DNA或RNA雙鏈RNA以及DNA/RNA雜合雙鏈都不能結(jié)合在膜上。轉(zhuǎn)化因子的吸收。雙鏈DNA分子與結(jié)合蛋白作用后，激活鄰近的核酸酶，一條鏈被降解，而另一條鏈則被吸收到受體菌中。整合復(fù)合物前體的形成。進(jìn)入受體細(xì)胞的單鏈DNA與另一種游離的蛋白因子結(jié)合，形成整合復(fù)合物前體結(jié)構(gòu)，它能有效地保護(hù)單鏈DNA免受各種胞內(nèi)核酸酶的降解，并將其引導(dǎo)至受體菌染色體DNA處。轉(zhuǎn)化因子單鏈DNA的整合。供體單鏈DNA片段通過同源重組，置換受體染色體DNA的同源區(qū)域，形成異源雜合雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。二、受體細(xì)胞受體細(xì)胞(receptorcell)：又稱為宿主細(xì)胞(hostcell)，是指能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定維持的細(xì)胞感受態(tài)(competence)：是指細(xì)菌吸收外源DNA的生理狀態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞(competencecell)：是指具有接受外源DNA能力的細(xì)胞。1、原核生物細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)大部分原核生物細(xì)胞沒有纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA的進(jìn)入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，這為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩基因組簡單，不含線粒體和質(zhì)體基因組，便于對引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。原核生物多數(shù)為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快。原核生物細(xì)胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)，即使許多真核生物基因得以表達(dá)，得到的也多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。原核生物細(xì)胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。原核生物細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定等。2、原核生物細(xì)胞表達(dá)真核生物基因存在的缺點(diǎn)：3、被用作受體菌的原核生物：大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)細(xì)菌等。大腸桿菌受體細(xì)胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點(diǎn)：大腸桿菌細(xì)胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)?？莶輻U菌受體細(xì)胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優(yōu)點(diǎn)：枯草桿菌具有胞外酶分泌－調(diào)節(jié)基因，能將具有表達(dá)的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性。枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌。枯草桿菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)?？莶輻U菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用：已成功的用于表達(dá)人的β干擾素、白細(xì)胞介素乙型肝炎病毒核心抗原和動物口蹄疫病毒VPI抗原等。藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）藍(lán)藻——又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)

和光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、能進(jìn)行光合作用，但它又具有細(xì)菌的特征，無細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在：基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA的檢測。細(xì)胞壁屬G-，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍(lán)藻，就可達(dá)到錦上添花的效果。4、真核生物細(xì)胞真菌受體細(xì)胞真菌是低等的真核生物，其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及蛋白質(zhì)的加工與分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌細(xì)胞表達(dá)高等動植物基因具有原核生物細(xì)胞無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。酵母菌酵母菌作為外源真核基因表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一,其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚,遺傳操作相對較為簡單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不含有特異性的病毒，不產(chǎn)生毒素，有些酵母菌屬(如釀酒酵母)在儀器工業(yè)中有著幾百年的應(yīng)用歷史，屬于安全型基因工程受體系統(tǒng)。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工等。動物細(xì)胞常用的動物受體細(xì)胞有Hela細(xì)胞、猴腎細(xì)胞和中國倉鼠巢細(xì)胞(CHO)等。哺乳動物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)是：能識別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪接加工成成熟的RNA。真核基因表達(dá)蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾,產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性,約為酵母細(xì)胞16-20倍。易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性。經(jīng)轉(zhuǎn)化的動物細(xì)胞可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺點(diǎn)是:組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，如培養(yǎng)和篩選一個高度擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化子CHO細(xì)胞，通常需要數(shù)月之久,難度較大。目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟(jì)動物和鼠、猴等實(shí)驗(yàn)動物，主要用途在于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動物疫苗、動物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。常用的動物受體細(xì)胞有小鼠L細(xì)胞、Hele細(xì)胞猴腎細(xì)胞和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)等。以動物細(xì)胞，尤其是哺乳動物細(xì)胞作為受體細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)植物受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：全能性，即一個分離的活細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。缺點(diǎn)：植物細(xì)胞有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，不利于攝取重組DNA分子?，F(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟(jì)作物和擬南芥等模式植物。5、選擇受體細(xì)胞的基本原則便于重組DNA分子的導(dǎo)入。便于重組體的篩選。根據(jù)所用的表達(dá)載體所含的選擇性標(biāo)記與受體細(xì)胞基因是否相匹配，從而易于對重組體進(jìn)行篩選。遺傳穩(wěn)定性高，易于進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或易于進(jìn)行高密度發(fā)酵而不影響外源基因的表達(dá)效率。對動物細(xì)胞而言，所選用的受體細(xì)胞具有對培養(yǎng)的適應(yīng)性強(qiáng)，可以進(jìn)行貼壁或懸浮培養(yǎng)，可以在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

受體細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)積累，可促進(jìn)外源基因高效分泌表達(dá)。安全性高，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染。一般選用致病缺陷型的細(xì)胞或營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞作為受體細(xì)胞。能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中。從受體細(xì)胞的角度出發(fā)，通常的做法是對其作適當(dāng)?shù)男揎椄脑欤邕x用某些限制性核酸內(nèi)切酶缺陷型的受體細(xì)胞就可以避免其對重組DNA分子的降解破壞作用。受體細(xì)胞在遺傳密碼子的應(yīng)用上無明顯偏倚性。具有較好的轉(zhuǎn)譯后加工機(jī)制等，便于真核目的基因的高效表達(dá)。在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價值。6、受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件野生型的大腸桿菌不是理想的受體細(xì)胞，因?yàn)樽陨砭哂械南拗坪托揎椣到y(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性因此必須通過適當(dāng)?shù)恼T變手段對野生型大腸桿菌進(jìn)行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株通常應(yīng)從以下幾個方面加以考慮：從安全性考慮，應(yīng)具備以下條件：不適合在人體內(nèi)生存不適合在非培養(yǎng)條件下生存在非培養(yǎng)條件下，其DNA容易解體它的DNA不易轉(zhuǎn)移它的質(zhì)粒只在這一宿主由復(fù)制便于檢測從遺傳性考慮：重組缺陷型recA－，用于基因擴(kuò)增或高效表達(dá)的受體細(xì)胞（recA-）限制系統(tǒng)的缺陷，或是修飾系統(tǒng)的缺陷。避免對外源DNA的除解。外切酶和內(nèi)切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-）

與重組質(zhì)粒的遺傳性狀要有顯的差異（具有與載體選擇標(biāo)記互補(bǔ)的表型）具有較高的轉(zhuǎn)化效率限制缺陷型這是導(dǎo)致外源重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主要原因之一。應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細(xì)胞，以提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。進(jìn)一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細(xì)胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。大腸桿菌的限制系統(tǒng)主要由hsdR

基因編碼，因此具有hsdR-遺傳表型的大腸桿菌各株均喪失了降解外源DNA的能力，同時大大增加了外源DNA的可轉(zhuǎn)化性。重組缺陷型進(jìn)入野生型細(xì)胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應(yīng)由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。RecA蛋白能促進(jìn)DNA分子之間的同源聯(lián)會和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至106。大腸桿菌的recB、recC

和recD

基因分別編碼不同分子量的多肽鏈，三者構(gòu)成一個在同源重組中的統(tǒng)一功能單位—RecBCD蛋白（核酸酶V），它具有依賴于ATP的雙鏈DNA外切酶和單鏈DNA內(nèi)切酶雙重活性。recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率因此受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個基因同時失活。轉(zhuǎn)化親和型可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞壁的通透性及細(xì)胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導(dǎo)形成感受態(tài)細(xì)胞的菌株作為受體菌細(xì)胞。遺傳互補(bǔ)型遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測。通常是使受體細(xì)胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標(biāo)記互補(bǔ)的遺傳性狀。方能使轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選成為可能。如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有AMP抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對這種抗生素敏感。當(dāng)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后載體上的標(biāo)記基因賦予受體細(xì)胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。如果受體細(xì)胞具有與外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性互補(bǔ)的遺傳特征．可以直接篩選到外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。感染寄生缺陷型相當(dāng)多的細(xì)菌對其它生物尤其是人和牲畜具有感染和寄生效應(yīng)，重組DNA分子導(dǎo)入這些細(xì)菌受體中后，極有可能隨著受體菌的感染寄生作用，進(jìn)入生物體內(nèi)，并廣泛圍傳播，如果外源基因?qū)θ梭w和牲畜有害，則會導(dǎo)致一場災(zāi)難，因此從安全的角度上考慮，受體細(xì)胞不能具有感染寄生性，當(dāng)然，利用基因工程手段制造生物武器不在此例。三、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法轉(zhuǎn)化(transformation):指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA分子的過程。轉(zhuǎn)化子(transformant)：經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得外源遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染(transfection):指感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞捕獲噬菌體或以它為載體構(gòu)建的重組DNA分子的過程轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction):指病毒轉(zhuǎn)移真核細(xì)胞DNA的過程或噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌細(xì)胞之間基因轉(zhuǎn)移的過程。基因?qū)胧荏w細(xì)胞方法根據(jù)轉(zhuǎn)移基因方法特性可分為：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)染(transfection)微注射技術(shù)(microinjection)電轉(zhuǎn)化法(electroporation)基因槍技術(shù)(geneblaster)脂質(zhì)體介導(dǎo)法(liposomemediatedtransfer)根據(jù)轉(zhuǎn)移基因載體與受體的特性可分為：質(zhì)粒載體導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法：CaCl2、電轉(zhuǎn)化法等。噬菌體轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法：體外包裝感染法等。DNA導(dǎo)入酵母菌的方法：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔轉(zhuǎn)化法等。DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞的方法：Ti質(zhì)粒葉盤法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、基因槍法等。DNA導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞的方法：桿狀病毒感染法等。DNA導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞的方法：磷酸鈣共沉淀法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、基因槍法等1、氯化鈣轉(zhuǎn)化法大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的正是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNA分子而非來自供體菌的游離DNA片段(轉(zhuǎn)化因子)。因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法之一是Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。1970年M.Mandel和A.Hige發(fā)現(xiàn),大腸桿菌經(jīng)過氯化鈣適當(dāng)處理及短暫熱休克之后,便能吸收λ噬菌體DNA。1972年美國斯坦福大學(xué)S.Cohen報(bào)道,經(jīng)氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞也能攝取質(zhì)粒DNA。Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化原理：①在0℃的Cacl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時Cacl2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。②Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42℃熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。Mg2+對DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用Mgcl2與Cacl2共同處理大腸桿菌細(xì)胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進(jìn)一步處理細(xì)胞，能誘導(dǎo)高頻感受態(tài)細(xì)胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高100～1000倍，且對大小質(zhì)粒分子均可進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。但該法要求條件高，對外界污染物極為敏感，通常很少采用。該法重復(fù)性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細(xì)胞。對這種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化如果感受態(tài)細(xì)胞做得好，每微克超螺旋質(zhì)粒DNA可得5×107～1×109個轉(zhuǎn)化子。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備：100ml菌體培養(yǎng)至OD600=0.5，離心收集菌體。用10ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體，離心收集菌體。用1ml冰冷的75mM

CaCl2溶液懸浮菌體。冰浴放置12-24小時，備用。取100ml感受態(tài)細(xì)胞，加入相當(dāng)于50ng載體的重組DNA連接液，混勻。冰浴放置半小時。在42℃保溫1.5分鐘（熱脈沖）?？焖賹⑥D(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)移至冰浴中放置1–2分鐘。

加入1ml新鮮培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)1小時（擴(kuò)增）。涂在合適的固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。

獲得合格的感受態(tài)細(xì)胞，要注意以下幾點(diǎn)：用作受體菌的細(xì)胞在培養(yǎng)時要掌握好細(xì)胞密度，一般在A600為0.4左右為好。制備受體細(xì)胞的整個過程要在0～4℃進(jìn)行，并盡量避免污染。如果用抗生素篩選轉(zhuǎn)化子，作為對照的受體菌應(yīng)該在此培養(yǎng)基上不生長。為了提高轉(zhuǎn)化率，可選用復(fù)合氯化鈣溶液，如FSB溶液。CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化DNA時，低溫的主要目的是:（1）抑制細(xì)胞的旺盛生理代謝。（2）有助于DNA-Ca2+吸附于細(xì)胞表面。（3）防止DNAase降解DNA。熱休克溫度是42℃。目的是使細(xì)胞攝入吸附于其表面的DNA?！D(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對照處理：DNA對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.2ml無菌水代替0.2m1感受態(tài)細(xì)胞，檢驗(yàn)DNA溶液是否染菌。感受態(tài)細(xì)胞對照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.1mlNTE緩沖液(500mMNaCl，10mMTris-HCl，1mMEDTApH8.0)代替0.1m1DNA溶液，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞是否染菌。感受態(tài)細(xì)胞有效性對照處理。在0.2ml感受態(tài)細(xì)胞中加入0.1ml已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒DNA。2、PEG介導(dǎo)的細(xì)菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性細(xì)菌（如枯草桿菌、鏈霉菌等）接納外源DNA的主要屏障是細(xì)胞壁，因而這類細(xì)菌通常采用原生質(zhì)體（細(xì)胞去壁后的形態(tài)）轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)移質(zhì)粒或重組DNA分子。酵母菌、霉菌、植物細(xì)胞也可用原生質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。PEG是乙二醇的多聚物,存在不同分子量的多聚體,它可改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu),使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中脂類分子發(fā)生疏散和重組,此時相互接觸的兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通成為可能,從而造成細(xì)胞之間發(fā)生融合。細(xì)菌原生質(zhì)體的制備：不同細(xì)菌的原生質(zhì)體制備方法不盡相同，以鏈霉菌為例：細(xì)菌需生長在高滲培養(yǎng)基中（如34%的蔗糖溶液），并加入甘氨酸以增加細(xì)菌細(xì)胞壁對溶菌酶的敏感性。在制備過程中，菌體應(yīng)始終懸浮在10.3%的蔗糖等滲溶液中。與原生質(zhì)體接觸的所有器皿應(yīng)保持無水無去污劑。

細(xì)菌原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：取0.2-1ml的原生質(zhì)體懸浮液（108-109個原生質(zhì)體），加入10-20mlDNA重組連接液，同時加入含有PEG1000和Ca2+的等滲溶液，混勻。

細(xì)菌原生質(zhì)體的再生：原生質(zhì)體再生的主要目的是使細(xì)菌重新長出細(xì)胞壁。再生在特殊的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，內(nèi)含脯氨酸和微量元素。3、電轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化又稱電穿孔法(electroporation):是指在細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，在質(zhì)膜上形成納米大小的微孔，DNA直接通過這些微孔或者作為微孔閉合時所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，這種方法稱為電穿孔法。最早用于將DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞,1988年,Dower等人成功應(yīng)用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化?；驹硎抢酶邏弘娒}沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔，形成可逆的瞬間通道,從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。

將待轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；駾NA重組連接液加在電穿孔轉(zhuǎn)化儀的樣品池中，兩極施加高壓電場。在強(qiáng)大電場的作用下，細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜產(chǎn)生縫隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔轉(zhuǎn)化法操作簡單，而且?guī)缀鯇λ泻?xì)胞壁結(jié)構(gòu)的受體細(xì)胞均有效，但轉(zhuǎn)化效率差別很大。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場強(qiáng)度、電脈沖時間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每μgDNA可以得到109～1010轉(zhuǎn)化子。電壓增高或電脈沖時間延長時，轉(zhuǎn)化效率將會有所提高，但同時導(dǎo)致受體細(xì)胞存活率的降低，轉(zhuǎn)化效率的提高也因此被抵消。用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞的制備容易得多．當(dāng)細(xì)菌生長到對數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度，并用10％甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3×l010個／m1。分裝，在干冰上速凍后置于-70℃貯存。這樣，每小份細(xì)胞融解后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達(dá)6個月以上。電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(0-4℃)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。4、接合轉(zhuǎn)化：接合（Conjugation）：指通過細(xì)菌細(xì)胞之間的直接接觸導(dǎo)致DNA從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至另一個細(xì)胞的過程。這個過程是由結(jié)合型質(zhì)粒完成的，它通常具有促進(jìn)供體細(xì)胞與受體細(xì)胞有效接觸的接合功能以及誘導(dǎo)DNA分子傳遞的轉(zhuǎn)移功能，兩者均由接合型質(zhì)粒上的有關(guān)基因編碼是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式．適用于那些難以采用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所須的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細(xì)胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果宿主細(xì)胞中存在另外一種溶合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒）非接合型質(zhì)粒通常也會被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著宿主細(xì)胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒DNA分子也不能直接接進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化。而只能通過其遷移作用來完成。首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。整個接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細(xì)菌菌株即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。5、重組λ噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌

轉(zhuǎn)染：將重組λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染。將重組λ噬菌體DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導(dǎo)操作。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)：指通過λ噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。具有感染能力的λ噬菌體顆粒除含有λ噬菌體DNA分子外，還包括外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細(xì)胞，首先必須對重組λ噬菌體DNA分子進(jìn)行體外包裝。體外包裝，是指在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。基本原理：根據(jù)λ噬菌體DNA體內(nèi)包裝的途徑分別獲得缺失D包裝蛋白的λ噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的λ噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨(dú)地包裝λ噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能包裝λ噬菌體DNA。λ噬菌體DNA體外包裝的主要過程①制備包裝物。須培養(yǎng)兩種溶原菌誘導(dǎo)溶菌生長收集和貯存包裝物。②體外包裝。制備λ噬菌體DNA混合液。第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r，細(xì)胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。第二次包裝。進(jìn)行第二次包裝，可提高包裝效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包裝反應(yīng)液的黏度，便于包裝反應(yīng)的進(jìn)行。去除細(xì)胞屑。第二次包裝后，在反應(yīng)液中加入SM溶液（噬菌體稀釋緩沖液：100mmol/LNaCl,

10mmol/LMgSO4,

50mmol/LTris-HCLpH7.5)0.2%明膠和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆?？梢愿腥具m當(dāng)?shù)氖荏w菌細(xì)胞，并將重組λ噬菌體DNA分子高效導(dǎo)入細(xì)胞中。在良好的體外包裝反應(yīng)條件下，每μg野生型的λ噬菌體DNA可形成108～109的pfu。對于重組的λ噬菌體DNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達(dá)到106～107pfu，完全可以滿足構(gòu)建真核基因組基因文庫的要求。6、轉(zhuǎn)化率的計(jì)算及其影響因素轉(zhuǎn)化率：指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率。轉(zhuǎn)化率是衡量轉(zhuǎn)化效率的重要指標(biāo)，有兩種表示方式：一是在待轉(zhuǎn)化DNA分子數(shù)大于受體細(xì)胞數(shù)的條件下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與細(xì)胞總數(shù)之比。二是在受體細(xì)胞數(shù)相對于待轉(zhuǎn)化DNA分子數(shù)大大過量時，每微克DNA轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的克隆數(shù)。也可表征為每微克DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的分子數(shù)影響轉(zhuǎn)化率的因素載體及重組DNA方面載體本身的性質(zhì)：不同的載體轉(zhuǎn)化同一株受體細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化率不同。分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較高，分子質(zhì)量較大的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較低，對于大于30kb的重組質(zhì)粒則很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。載體的空間構(gòu)象：與受體細(xì)胞親和性較強(qiáng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體。質(zhì)粒的超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高，經(jīng)酶切連接操作后的載體由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，一般要比新制備的超螺旋質(zhì)粒低兩個數(shù)量級。插入