小麥葉片生理指標測定

小麥葉片生理指標測定一、種子處理：1、0.1%氯化汞浸泡小麥種子30分鐘，進行消毒，小麥種子放在較大的培養(yǎng)皿中2、將氯化汞倒入廢液瓶，注意必須戴兩層手套，因為氯化汞劇毒，且用完的手套不能碰實驗室里其它的任何東西，以防污染，最好把用完的手套放到DNA顯色室中的廢手套收集桶里；3、然后用無菌蒸餾水沖洗3遍以上4、最后用倒入適量無菌水（稍微讓水浸沒種子表面）進行種子萌發(fā),每天換次新水。二、小麥培養(yǎng)1、在種子發(fā)芽以后，在芽長1cm左右的時候，將種子放入用網(wǎng)縫好的塑料泡沫上，然后放入裝有自來水的培養(yǎng)盒中2、大概三天左右的時間，將水倒掉，換上1/2hoagland營養(yǎng)液（配方見下面的附件），每三天換一次營養(yǎng)液。三、小麥處理及指標測定1、小麥培養(yǎng)兩周后，在兩葉一心期，用適當PEG6000濃度的1/2hoagland營養(yǎng)液換掉原營養(yǎng)液，各設一個對照（即沒加PEG6000的1/2hoagland營養(yǎng)液）2、每隔24h取一次樣，在72h后復水（即將PEG6000溶液倒掉，換成新配的1/2hoagland營養(yǎng)液）四、生理指標測定1、相對含水量測定1?鮮重測定迅速剪取植物材料，裝入已知重量的容器（或塑料袋）中，帶入室內(nèi)，用分析天平稱取鮮重（FW）。2?飽和鮮重測定將稱過鮮重的植物材料浸入水中，數(shù)小時后取出，用吸水紙吸干表面水分，立即稱重；再次將材料放入水中浸泡一段時間后，再次取出，吸干表面水分，稱鮮重，直到兩次稱重的結(jié)果基本相等,最后的結(jié)果即為飽和鮮重（SFW）。若事先已知達到水分飽和所用的時間，則可一次取得飽和鮮重的測量定值。3?干重測定提前把烘箱打開，溫度升至120°C。把稱過鮮重的植物材料裝入紙袋中，放入烘箱內(nèi)，120°C殺青1Omin,然后把烘箱的溫度降到70C左右，烘至恒重。取出紙袋和材料，放入干燥器中冷卻至室溫，稱干重（DW）。4?取得以上數(shù)據(jù)后，按公式相對含水量。相對含水量=FW-DW/SFW-DW2、MDA含量測定一、目的通過實驗，掌握植物體內(nèi)丙二醛含量測定的原理及方法。二、原理丙二醛（MDA）是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應而產(chǎn)生的。它的含量與植物衰老及逆境傷害有密切關系。測定植物體內(nèi)丙二醛含量,通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應，生成紅棕色的三甲川（3、5、5—三甲基惡唑2、4—二酮），三甲川最大的吸收波長在532nm。但是測定植物組織中MDA時受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與硫代巴比妥酸顯色反應產(chǎn)物的最大吸收波長在450nm處，在532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時可溶性糖增加，因此測定植物組織中丙二醛與硫代巴比妥酸反應產(chǎn)物含量時一定要排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排除。低濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖或丙二醛顯色反應物在532、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛與硫代巴比妥酸顯色反應中需要有一定的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100—300“g?g-iDw，根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3+的終濃度為0.5nmol?L-1。在532nm、600nm和450nm波長處測定吸光度值，即可計算出丙二醛含量。三、材料、儀器設備及試劑材料：植物葉片。儀器設備：離心機，分光光度計；電子分析天平；恒溫水??；研缽；試管；移液管（1ml、5ml）、試管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3?試劑：10%三氯乙酸；0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。四、實驗步驟丙二醛的提取

稱取受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片lg,加入少量石英砂和10%三氯乙酸2ml,研磨至勻漿，再加8ml10%三氯乙酸進一步研磨，勻漿以4000r/min離心10min,其上清液為丙二醛提取液。顯色反應及測定取4支干凈試管，編號，3支為樣品管(三個重復)，各加入提取液2ml,對照管加蒸餾水2ml，然后各管再加入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液。搖勻，混合液在沸水浴中反應15min，迅速冷卻后再離心。取上清液分別在532、600和450nm波長下測定吸光度(A)值。五、丙二洽量計算:五、丙二洽量計算:由于蔗糖一TBA反應產(chǎn)物的最大吸收波長為450nm，毫摩爾吸收系數(shù)為85.4X10-3,MDA-TBA反應產(chǎn)物在532nm的毫摩爾吸收系數(shù)分別是7.4X10-3和155X10-3。532nm非特異性吸光值可以600nm波長處的吸光值代表。按雙組分分光光度法原理，建立方程組，解此方程組即可求出MDA及可溶性糖濃度。方程組：A=(85.4X10-3)?C糖450(A-A)=(155X10-3)?C+(7.4X10-3)?C糖532600MDA解得：A450C糖二=11.71A(mmol?L-1)45085.4X10-3C=6.45(A-A)-0.56A(umol?L-1)MDA532600450-1公式中：A—在450nm波長下測得的吸光度值450A532—在532nm波長下測得的吸光度值A一在600nm波長下測得的吸光度值600*一1.55X105為摩爾比吸收系數(shù)C糖、C分別是反應混合液中可溶性糖、MDA的濃度。MDA按下式計算提取液中MDA濃度反應液體積(ml)CXMDA1000提取液中MDA濃度(umol?ml-1)二測定時提取液用量(ml)按下式計算樣品中MDA含量提取液中MDA濃度(umol?ml-1)X提取液總量(ml)MDA含量(Umol?g-1Fw)=植物組織鮮重(g)附：hoagland營養(yǎng)液配方改良霍格蘭配方：四水硝酸鈣945mg/L硝酸鉀506mg/L硝酸銨80mg/L磷酸二氫鉀136mg/L硫酸鎂493mg/L鐵鹽溶液2.5ml微量元素液5mlpH=6.0鐵鹽溶液：七水硫酸亞鐵2.78g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA.Na）3.73g蒸餾水500mlpH=5.5微量元素液：碘化鉀0.83mg/l硼酸6.2mg/L硫酸錳22.3mg/L硫酸鋅8.6mg/L鉬