顯微鏡的種類及其使用方法

附圖1-1附圖1-1普通光朝篇鏡的結(jié)所1目鏡我物鏡;光波；4聚光器￡&光圈；?6鏡座#7鏡柱；§鰻鏡胃；9藐筒；；10轉(zhuǎn)換器W'211粗準焦螺旋;細誰焦螺旋壬13載物臺沁M彈箜夾；1：5推動器；16逢光器/顯微鏡的種類及其使用方法一、光學顯微鏡光學顯微鏡是一種精密的光學儀器。當前使用的顯微鏡由一套透鏡配合，因而可選擇不同的放大倍數(shù)對物體的細微結(jié)構(gòu)進行放大觀察。普通光學顯微鏡通常能將物體放大1500?2000倍(最大的分辨力為0.2pm)。光學顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)(附圖-1)光學部分包括目鏡、物鏡、聚光器和光源等。目鏡：通常由兩組透鏡組成，上端的一組又稱為“接目鏡”，下端的則稱為“場鏡”。兩者之間或在場鏡的下方裝有視場光闌(金屬環(huán)狀裝置)，經(jīng)物鏡放大后的中間像就落在視場光闌平面上，所以其上可加置目鏡測微尺。在目鏡上方刻有放大倍數(shù)，如10x、20x等。按照視場的大小，目鏡可分為普通目鏡和廣角目鏡。有些顯微鏡的目鏡上還附有視度調(diào)節(jié)機構(gòu)，操作者可以對左右眼分別進行視度調(diào)整。另有照相目鏡(NFK)可用于拍攝。物鏡：由數(shù)組透鏡組成，安裝于轉(zhuǎn)換器上，又稱接物鏡。通常每臺顯微鏡配備一套不同倍數(shù)的物鏡，包括:①低倍物鏡：指1x?6x；②中倍物鏡：指6x?25x；③高倍物鏡：指25x?63x:④油浸物鏡：指90x?100x。其中油浸物鏡使用時需在物鏡的下表面和蓋玻片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體(如香柏油等)，它能顯著地提高顯微觀察的分辨率。其他物鏡則直接使用。觀察過程中物鏡的選擇一般遵循由低到高的順序，因為低倍鏡的視野大，便于查找待檢的具體部位。顯微鏡的放大倍數(shù)，可粗略視為目鏡放大倍數(shù)與物鏡放大倍數(shù)的乘積。聚光器：由聚光透鏡和虹彩光圈組成，位于在載物臺下方。聚光透鏡的功能是將光線聚焦于視場范圍內(nèi)；透鏡組下方的虹彩光圈可開大縮小，以控制聚光器的通光范圍，調(diào)節(jié)光的強度，影響成像的分辨力和反差。使用時應根據(jù)觀察目的，配合光源強度加以調(diào)節(jié)，得到最佳成像效果。光源：較早的普通光學顯微鏡借助鏡座上的反光鏡，將自然光或燈光反射到聚光器透鏡的中央作為鏡檢光源。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成。不用聚光器或光線較強時用凹面鏡，凹面鏡能起會聚光線的作用；用聚光器或光較弱時，一般都用平面鏡。新近出產(chǎn)的顯微鏡一般直接在鏡座上安裝光源，并有電流調(diào)節(jié)螺旋，用于調(diào)節(jié)光照強度。光源類型有鹵素燈、鎢絲燈、汞燈、熒光燈、金屬鹵化物燈等。顯微鏡的光源照明方法分為兩種：透射型與反射■(落射)型。前者是指光源由下而上通過透明的鏡檢對象；反射型顯微鏡則是以物鏡上方打光到(落射照明)不透明的物體上。機械部分包括鏡座、鏡柱、鏡壁、鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、載物臺和準焦螺旋等。鏡座：基座部分，用于支持整臺顯微鏡的平穩(wěn)。鏡柱：鏡座與鏡臂之間的直立短柱，起連接和支持的作用。鏡臂：顯微鏡后方的弓形部分，是移動顯微鏡時握持的部位。有的顯微鏡在鏡臂與鏡柱之間有一活動的傾斜關(guān)節(jié)，可調(diào)節(jié)鏡筒向后傾斜的角度，便于觀察。鏡筒：安裝在鏡臂先端的圓筒狀結(jié)構(gòu)，上連目鏡，下連接物鏡轉(zhuǎn)換器。顯微鏡的國際標準筒長為160mm，此數(shù)字標在物鏡的外殼上。物鏡轉(zhuǎn)換器：鏡筒下端的可自由旋轉(zhuǎn)的圓盤，用于安裝物鏡。觀察時通過轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器來調(diào)換不同倍數(shù)的物鏡。載物臺：鏡筒下方的平臺，中央有一圓形的通光孔。用于放置載玻片。載物臺上裝有固定標本的彈簧夾，一側(cè)有推進器，可移動標本的位置。有些推動器上還附有刻度，可直接計算標本移動的距離以及確定標本的位置。（7） 準焦螺旋：裝在鏡臂或鏡柱上的大小兩種螺旋，轉(zhuǎn)動時可使鏡筒或載物臺上下移動，從而調(diào)節(jié)成像系統(tǒng)的焦距。大的稱為粗準焦螺旋，每轉(zhuǎn)動一圈，鏡筒升降10mm；小的為細準焦螺旋，轉(zhuǎn)動一圈可使鏡筒僅升降0.1mm。一般在低倍鏡下觀察物體時，以粗準焦螺旋迅速調(diào)節(jié)物像，使之位于視野中。在此基礎(chǔ)上，或在使用高倍鏡時，用細準焦螺旋微調(diào)。必須注意，一般顯微鏡裝有左右兩套準焦螺旋，作用相同，但切勿兩手同時轉(zhuǎn)動兩側(cè)的螺旋，防止因雙手力量不均產(chǎn)生扭力，導致螺旋滑絲。（二） 普通光學顯微鏡的基本成像原理光線一（反光鏡）一遮光器一通光孔一鏡檢樣品（透明）一物鏡的透鏡（第一次放大成倒立實像）一鏡筒―目鏡（再次放大成虛像）一眼。（三） 普通光學顯微鏡的使用過程鏡檢前的準備室內(nèi)應清潔而干燥，實驗臺臺面水平，穩(wěn)固無震動，顯微鏡附近不應放置腐蝕性的試劑。從顯微鏡柜或鏡箱內(nèi)取出顯微鏡時，要用右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，平穩(wěn)地取出，放置在實驗臺桌面上，置于操作者左前方，距實驗臺邊緣約10cm，鏡臂朝自己，鏡筒朝前。實驗臺右側(cè)放繪圖用具。調(diào)節(jié)光源如需利用外置光源，宜采用散射的自然光或柔和的燈光。直射的太陽光會對觀察者的眼睛造成傷害。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡正對通光孔，將聚光器上的虹彩光圈開到最大，觀察目鏡中視野亮度，同時調(diào)節(jié)反光鏡角度，使光照達到最明亮最均勻。自帶光源的顯微鏡，可通過調(diào)節(jié)電流旋鈕來調(diào)節(jié)光照的強弱。裝置待檢玻片將待觀察的樣品制作成臨時或永久裝片，放在載物臺上，用彈簧夾固定，有蓋玻片的一面朝上。移動推進器，調(diào)節(jié)待檢樣品至通光孔的中心。低倍鏡觀察將低倍鏡對準通光孔，緩緩轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，將物鏡與裝片的距離調(diào)至最近。注意不要壓碎蓋玻片。通過目鏡觀察，同時用粗準焦螺旋緩慢調(diào)節(jié)，直至物像出現(xiàn)，再用細準焦螺旋微調(diào)，同時調(diào)節(jié)光源亮度與虹彩光圈的大小，使物像達到最清晰的程度。并利用推進器把需要進一步放大觀察的部分移至視野中央。如果使用雙筒目鏡，應在觀察前先調(diào)整雙筒距離，使兩眼視場合并。高倍鏡觀察轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，選擇較高倍數(shù)的物鏡，用細準焦螺旋調(diào)節(jié)焦距，到物像清晰為止。油鏡觀察油浸物鏡的工作距離（指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離）很短，一般在0.2mm以內(nèi)，且一般光學顯微鏡的油浸物鏡沒有“彈簧裝置”，因此使用油浸物鏡時，調(diào)焦速度必須放慢，避免壓碎玻片，并使物鏡受損。（1） 在低倍鏡下找到觀察目標，中、高倍鏡下逐步放大，將待觀察部位置于視野中央，調(diào)節(jié)光源和虹彩光圈，使通過聚光器的光亮達到最大。（2）轉(zhuǎn)動粗準焦螺旋，將鏡筒上旋（或?qū)⑤d物臺下降）約2cm，加一小滴香柏油于玻片的鏡檢部位上。（3） 將粗準焦螺旋緩緩轉(zhuǎn)回，同時注意從側(cè)面觀察，直至油鏡浸入油滴，鏡頭幾乎與標本接觸。（4） 從目鏡中觀察，用細準焦螺旋微調(diào)，直至物象清晰。（5） 鏡檢結(jié)束后，將鏡頭旋離玻片，立即清潔鏡頭。一般先用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油滴。再用擦鏡紙蘸少許乙醚-酒精混合液（2：3），擦去殘留油跡，最后再用干凈的擦鏡紙擦凈（注意向一個方向擦拭）。還原顯微鏡關(guān)閉內(nèi)置光源并拔下電源插頭，或使反光鏡與聚光器垂直。旋轉(zhuǎn)物鏡轉(zhuǎn)換器，使物鏡頭呈八字形位置

與通光孔相對。再將鏡筒與載物臺距離調(diào)至最近，降下聚光器。罩上防塵罩，將顯微鏡放回柜內(nèi)或鏡箱中。二、幾種特殊的光學顯微鏡（一） 暗視野顯微鏡暗視野顯微鏡不具備觀察物體內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)的功能，但可以分辨0.004pm以上的微粒的存在和運動。因而常用于觀察活細胞的結(jié)構(gòu)和細胞內(nèi)微粒的運動等。暗視野顯微鏡的基本原理是丁達爾效應。當一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵'通路”，這種現(xiàn)象即丁達爾效應。暗視野顯微鏡在普通的光學顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內(nèi)部拋物面結(jié)構(gòu)的遮擋，照射在待檢物體表面的光線不能直接進入物鏡和目鏡，僅散射光能通過，因而視野是黑暗的。操作者通過目鏡觀察到的，是檢物體的衍射光圖像（附圖1-2）。暗視野顯微鏡的基本使用方法如下：安裝暗視野聚光器（或用厚實的黑紙片制成遮光板，放在普通顯微鏡的聚光器下方，也能得到暗視野效果）。選用強光源，一般用顯微鏡燈照明，以防止直射光線進入物鏡。颼1-2暗掘酸1颼1-2暗掘酸1物苗:；Z樣本；3環(huán)u431視場最光鏡F進行中心調(diào)節(jié)，即水平移動聚光器，使聚光器的光軸與顯微鏡的光軸嚴格位于一直線上。升降聚光器，將聚光鏡的焦點（圖2中圓錐光束的頂點）對準待檢物。陷1-3依式1旗座；陷1-3依式1旗座；2鏡架「J目疆；4物鏡；4■5放大倍數(shù)調(diào)節(jié)螺旋￡氏粗調(diào)岬旋上47細調(diào)螺旋;溟彈簧夾；9黑白拔z（二） 體視顯微鏡體視顯微鏡又稱實體顯微鏡或解剖鏡，其成像為正立三維的空間影像，并具有立體感強、成像清晰寬闊、長工作距離（通常為110mm）以及連續(xù)放大觀看等特點。生物學上常用于解剖過程中的實時觀察（附圖1-3）。普通光學顯微鏡的光源為平行光，因而形成的是二維平面影像；而體視顯微鏡采用雙通道光路，雙目鏡筒中的左右兩光束具有一定的夾角--體視角（一般為12°-15°），因而能形成三維空間的立體圖像。體視顯微鏡與普通光學顯微鏡的使用方法相近，但更為便捷。二者的主要區(qū)別在于：體視顯微鏡的鏡檢對象可不必制作成裝片。體視顯微鏡載物臺直接固定在鏡座上，并配有黑白雙面板或玻璃板，操作者可根據(jù)鏡檢的對象和要求加以選擇。體視顯微鏡的成像是正立的，便于解剖操作。體視顯微鏡的物鏡僅一只，其放大倍數(shù)可通過旋轉(zhuǎn)調(diào)節(jié)螺旋連續(xù)調(diào)節(jié)。（三） 熒光顯微鏡熒光顯微鏡是利用細胞內(nèi)物質(zhì)發(fā)射的熒光強度對其進行定性和定量研究的一種光學工具。細胞內(nèi)的熒光物質(zhì)物質(zhì)有兩類，一類直接經(jīng)紫外線照射后即可發(fā)熒光，如葉綠素等；另有一些物質(zhì)本身不具這一性質(zhì)，但如果以特定的熒光染料或熒光抗體染色，經(jīng)紫外線照射后亦可發(fā)熒光（附圖1-4）。熒光顯微鏡的原理為利用一個高發(fā)光效率的點光源（如超高壓汞燈），經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光（如紫外光3650人或紫藍光4200人）作為激發(fā)光，激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各色的熒光后，再通過物鏡后面的阻斷（或壓制）濾光片的過濾，最后經(jīng)由目鏡的放大作用加以觀察。阻斷濾光片的作用有二：一是吸收和阻擋激發(fā)光

進入目鏡以免干擾熒光和損傷眼睛；二是選擇并讓特定的熒光透過，表現(xiàn)出專一的熒光色彩。熒光顯微鏡按照光路原理可分為兩種：透射式熒光顯微鏡：較為舊式的熒光顯微鏡，其激發(fā)光源通過聚光鏡穿過標本材料來激發(fā)熒光。其優(yōu)點陷1-51陷1-51齡濾光片隊孜色素分■離黑：■'斷斯謁光片；4物鏡；5鏡牡對象：&目康；T光源＞■落射式熒光顯微鏡：激發(fā)光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡（附圖1-5）。光路中需加上一個雙色束分離器（分色鏡），它與光軸呈45°角，激發(fā)光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時進入物鏡，返回到雙色束分離器，使激發(fā)光和熒光分開，殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數(shù)愈大熒光愈強。（四）相差顯微鏡轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴姸龋┳兓娘@微鏡。主相差顯微鏡是能將光通過物體時產(chǎn)生的相位差（或光程差）要用于觀察活細胞、不染色的組織切片或缺少反差的染色標本。轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴姸龋┳兓娘@微鏡。主人眼只能鑒別可見光的波長（顏色）和振幅的變化，不能鑒別相位的變化。而大多數(shù)生物標本高度透明，光波通過后振幅基本不變，僅存在相位的變化。相差顯微鏡基本把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4X（波長），如果再增加或減少1/4人，則光程差變?yōu)?/2人，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差（見圖6）。從結(jié)構(gòu)上看，相差顯微鏡與普通光學顯微鏡不同之處在于：環(huán)形光闌具有環(huán)形開孔的光闌，安裝在光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，聚焦到標本上。2.相位板圖6相差顯微鏡原理*1相位板m發(fā)生偏離的光；3物浦24樣本；5圖6相差顯微鏡原理*1相位板m發(fā)生偏離的光；3物浦24樣本；5聚光器環(huán)形光族T；3光源（1） A+相板：將直射光推遲1/4人，兩組光波合軸后光波疊加，振幅加大，標本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加明亮，形成亮反差（或稱負反差）。（2） B+相板：將衍射光推遲1/4人，兩組光線合軸后光波相減，振幅變小，標本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加暗淡，形成暗反差（或稱正反差）。帶有相板的物鏡叫相差物鏡，常在物鏡外殼上標以“Ph”字樣。合軸調(diào)節(jié)望遠鏡相差顯微鏡配備有一個合軸調(diào)節(jié)望遠鏡（在外殼上標有“CT”符號），用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合，以便實現(xiàn)對直射光和衍射光的特殊處理。使用時撥去一側(cè)目鏡，插入合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，調(diào)節(jié)合軸調(diào)節(jié)望遠鏡的焦點，視野中會呈現(xiàn)兩個圓環(huán)，分別是明亮的環(huán)狀光闌圓環(huán)與較暗的相板上共軛面圓環(huán)。再轉(zhuǎn)動聚光器上的環(huán)狀光闌的兩個調(diào)節(jié)螺旋，使兩環(huán)完全重疊。如明亮的光環(huán)過小或過大，可調(diào)節(jié)聚光器的升降旋鈕，使兩環(huán)完全吻合。如果聚光器已升到最高點或降到最低點而仍不能矯正，說明玻片太厚了，

應更換。調(diào)好后即可取下合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，換回目鏡。綠色濾光片用于調(diào)整光源的波長。照明光線的波長不同，會引起相位的變化，為了獲得良好的相差效果，相差顯微鏡要求使用波長范圍比較窄的單色光，通常是用綠色濾光片來調(diào)整。相差顯微鏡的使用步驟如下：（1） 根據(jù)待檢標本的性質(zhì)及要求，挑選適合的相差物鏡。（2） 將標本玻片放到載物臺上，進行光軸中心的調(diào)整。（3） 使用合軸調(diào)節(jié)望遠鏡，調(diào)整環(huán)狀光闌與相板上的共軛面圓環(huán)完全重疊吻合后，換回目鏡。在觀察過程中，每次更換物鏡倍數(shù)時，必須重新進行環(huán)狀光闌與相板共軛面圓環(huán)吻合的調(diào)整。（4） 加綠色濾光片，按普通光學顯微鏡的操作步驟進行觀察。（五） 倒置顯微鏡倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)和普通顯微鏡基本相同，只不過物鏡與照明系統(tǒng)位置交換，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上。主要用于觀察培養(yǎng)的活細胞，需配制相差物鏡。（六） 偏光顯微鏡偏光顯微鏡可用于檢測具有雙折射性的物質(zhì)，如染色體、膠原、纖維絲等（附圖1-7）。和普通顯微鏡不同的是：偏光顯微鏡光源前配備偏振鏡（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光。鏡筒中有檢偏振鏡（檢偏器，一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器）。使用旋轉(zhuǎn)載物臺。當載物臺上放入單折射的物質(zhì)時，無論如何旋轉(zhuǎn)載物臺，由于兩個偏振片是垂直的，顯微鏡里看不到光線，而放入雙折射性物質(zhì)時，由于光線通過這類物質(zhì)時發(fā)生偏轉(zhuǎn)，因此旋轉(zhuǎn)載物臺便能檢測到這種物體。配備補償器或相位片；使用專用無應力物鏡。三、電子顯微鏡電子顯微鏡是利用高速運動的電子束來代替光波的一種顯微鏡。光學顯微鏡下只能清楚地觀察大于0.2pm的結(jié)構(gòu)。而小于0.2pm的結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)（submicroscopicstructures）或超微結(jié)構(gòu)（ultramicroscopicstructures；ultrastructures）。要想看清這些更為細微的結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。因此電子顯微鏡的分辨率遠高于光學顯微鏡，目前可達0.2nm，放大倍數(shù)可達80萬倍。電子顯微鏡的基本要結(jié)構(gòu)包括鏡筒、真空系統(tǒng)和電源柜三部分。鏡筒主要由電子槍、電子透鏡、樣品架、熒光屏和照相機構(gòu)等部件，自上而下地裝配成一個柱體；真空系統(tǒng)包括機械真空泵、擴散泵和真空閥門三部分，并通過抽氣管道與鏡筒相聯(lián)接；電源柜由高壓發(fā)生器、勵磁電流穩(wěn)流器和各種調(diào)節(jié)控制單元組成。電子透鏡是電子顯微鏡鏡筒中的關(guān)鍵部件?，F(xiàn)代電子顯微鏡大多采用電磁透鏡，由穩(wěn)定的直流勵磁電流通過帶極靴的線圈產(chǎn)生的強磁場使電子聚焦。電子槍的作用是發(fā)射并形成速度均勻的電子束，由燈絲（陰極）、柵極和陽極（加速極）構(gòu)成。陰極管發(fā)射的電子通過柵極上的小孔形成射線束，經(jīng)陽極電壓加速后射向聚光鏡，起到對電子束加速、加壓的作用。使用中加速電壓的穩(wěn)定度要求不低于萬分之一。電子顯微鏡按結(jié)構(gòu)和用途可分為透射式電子顯微鏡、掃描式電子顯微鏡、反射式電子顯微鏡和發(fā)射式電子顯微鏡等。其中生物學研究中使用最為廣泛的是透射式和掃描式電子顯微鏡。前者常用于觀察那些用普通顯微鏡所不能分辨的細微物質(zhì)結(jié)構(gòu)；后者主要用于觀察固體表面的形貌。透射式電子顯微鏡透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,TEM)的組件包括：電子槍發(fā)射電子，由陰極、柵極、陽極組成。聚光透鏡即電子透鏡，將電子束聚集，可用于控制照明強度和孔徑角。樣品室放置待觀察的樣品，并裝有旋轉(zhuǎn)臺，用以改變試樣的角度，還有裝配加熱、冷卻等設(shè)備。物鏡為放大率很高的短距透鏡，作用是放大電子像。物鏡是決定透射電子顯微鏡分辨能力和成像質(zhì)量的關(guān)鍵。中間鏡為可變倍的弱透鏡，作用是對電子像進行二次放大。通過調(diào)節(jié)中間鏡的電流，可選擇物體的像或電子衍射圖來進行放大。透射鏡為高倍的強透鏡，用將二次放大后的中間像進一步放大后在熒光屏上成像。二級真空泵對樣品室抽真空。照相裝置用以記錄影像。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，