實驗五 酵母菌形態(tài)的觀察和顯微鏡下細胞測量和計數(shù)

#實驗五酵母菌形態(tài)的觀察和顯微鏡下細胞測量和計數(shù)劉洋生物1011002040120一、實驗?zāi)康?、觀察酵母菌的形態(tài)，掌握區(qū)分酵母菌死活細胞的染色方法。2、掌握利用顯微測微尺測量酵母菌人小的方法。3、學(xué)習(xí)利用血球計數(shù)板測定微生物細胞數(shù)量的原理和方法。二、實驗原理（一）酵母菌的形態(tài)觀察酵母菌是單細胞真核微生物，細胞呈圓形、橢圓形或柱狀。酵母的細胞比細菌人得多，經(jīng)過特殊的染色，在高倍鏡下就可以觀察到。酵母菌既可無性繁殖，又可有性繁殖。無性繁殖有芽殖和裂殖兩種，芽殖又有單出、雙出和多出之分。酵母菌的有性生殖一般能形成4〃8個子糞飽子。在一定條件卞，有的酵母菌進行芽殖后，長人的子細胞不與母細胞立即分離，并繼續(xù)出芽，細胞成串排列，這種菌絲狀的細胞串就稱為假菌絲。假菌絲的各細胞間僅以狹小的面積相連，呈藕節(jié)狀。酵母菌的死活細胞可以通過美蘭染色加以區(qū)分。美蘭是一種無毒性染色劑，其氧化型為藍色，還原型為無色。由于活細胞具有較強的還原能力，可以使美蘭由藍色的氧化型轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色的還原型。處于代謝旺盛的細胞還原美蘭的能力強，細胞為無色，為代謝緩慢的老細胞、幼嫩芽體為淺藍色，死細胞為深藍色。（-）顯微鏡下的細胞計數(shù)本次實驗采用血球計數(shù)法測定微生物細胞數(shù)。方法是將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌體細胞或抱子懸液，加到血球計數(shù)板的計數(shù)室內(nèi)，在顯微鏡下逐格計數(shù)。因為計數(shù)室的容積是固定的（0.1mm3）,所以可以將在顯微鏡下計得的菌數(shù)換算成單位體積試樣中的菌數(shù)。血球計數(shù)板使一塊特制的載玻片，中部有H形的溝槽將中部分成上下兩個計數(shù)室。計數(shù)室方格的邊長為3mm,每個方格分為9個人方格，正中央的人方格被分為25個中方格，而每個中方格又被分為16個小方格。這樣正中央的人方格總共分成400個小方格，每個小方格的體積為l/4000mm3（計數(shù)室的高度為0.1mm）o由此得到如下公式：/、平均每個中方格內(nèi)的菌數(shù)每亳升的菌數(shù)（個）=————J…%桶釋倍數(shù)x4000x1000（三）顯微鏡下細胞大小的測量用來測屋微生物人小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。鏡臺測微尺專用于校正目鏡測微尺每格的長度，是中央部分可有精確等分線的載玻片。全長1mm,等分為100小格，每小格長lO^io目鏡測微尺的刻度刻在一個略小于目鏡內(nèi)徑的圓玻璃片上。將此測微尺放在目鏡內(nèi)觀察物彖時，可同時看見物象和測微尺，但是在配合不同放人倍數(shù)的物鏡時，目鏡測微尺每刻度間的長度會發(fā)生變化。所以，目鏡測微尺不能直接用來測量微生物的大小，使用前必須利用鏡臺測微尺進行校正。三、實驗材料1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）、熱帶假幺纟酵母（Candidatropicalis）2、染色劑：0.2%美蘭染液3、培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）4、其他：血球計數(shù)板、鏡臺測微尺、目鏡測微尺、載玻片、蓋玻片、無菌水、洗瓶、擦鏡紙、吸水紙、二甲苯、香柏油、接種用具

四、實驗方法（一）酵母菌的形態(tài)觀察2、芽殖觀察（2）制片：取一潔凈載玻片，在其中央滴一滴美蘭染液，用接種環(huán)取少量釀酒酵母菌苔在染液中涂勻。再用躡子取一蓋玻片，以45°角與菌懸液接觸后，輕輕蓋在菌懸液上，避免產(chǎn)生氣泡，用吸水紙吸干多余液體。（2）觀察：將水壓片置于高倍鏡卞觀察。觀察芽殖和死、活細胞的顏色。30min之后，再次觀察死、活細胞數(shù)是否發(fā)生了變化。2、假菌絲的觀察（1）培養(yǎng)：將熱帶假絲酵母劃線接種與馬鈴萼葡萄糖培養(yǎng)基平板表面，28'C培養(yǎng)2天，取出培養(yǎng)物,在無菌條件下，將一實現(xiàn)滅菌的無菌蓋玻片輕輕壓在劃線處，繼續(xù)培養(yǎng)2天。（2）觀察：打開培養(yǎng)皿蓋，與高倍鏡下直接觀察3、釀酒酵母菌子囊范子的觀察于高倍鏡下觀察子囊孑包子裝片，注意子囊抱子的數(shù)目和形狀。（二）顯微鏡下的細胞計數(shù)1、制備菌懸液：用無菌接種環(huán)在釀酒酵母菌斜面上刮卞適量菌苔，將菌苔分散在盛有5ml無菌水的試管中，充分振蕩。2、加菌液：先用擦鏡紙將血球計數(shù)室擦凈，用無菌滴管取著涼釀酒酵母菌懸液滴入上下兩個計數(shù)室內(nèi)，蓋上蓋玻片，不能有氣泡，否則重做。3、計數(shù)：現(xiàn)在顯微鏡下找到計數(shù)室，在正中央的大方格中沿對角線取9個中方格，計數(shù)每個中方格中的菌數(shù)，填入下表，并計算單位體積的菌數(shù)（個/ml）。（三）顯微鏡下細胞大小的測量2、校正目鏡測微尺（1）安裝目鏡測微尺：取出目鏡，旋開透鏡螺旋，將目鏡測微尺刻度朝卞放入目鏡筒，然后旋好螺旋，插入顯微鏡筒。（2）放置鏡臺測微尺：將鏡臺測微尺放在載物臺上，使刻度面朝上。（3）校正：在顯微鏡卞觀察，調(diào)準(zhǔn)焦距，當(dāng)看清鏡臺測微尺后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度相平行，然后移動推動器，使目鏡測微尺和鏡臺測微尺的某一區(qū)間的兩條刻度線完全重合，在數(shù)出兩條重合先之間各自所占的格數(shù)，根據(jù)公式得到校正后的目鏡測微尺每小格的長度。目鏡測微尺每小格的長度Gum）目鏡測微尺每小格的長度Gum）=兩條重合線間鏡臺測微尺的格數(shù)x10

兩條重合線間目鏡測微尺的格數(shù)2、制釀酒酵母水壓片：取一潔凈載玻片，在中央滴一滴上面制備的菌懸液，小心蓋上蓋玻片，用吸水紙將多余的液體吸干，不能產(chǎn)生氣泡。3、測量釀酒酵母菌體人?。簩⑨劸平湍杆畨浩旁谳d物臺上，在顯微鏡下看清菌體后，轉(zhuǎn)動目鏡測量酵母細胞菌體的直徑，共需測量20個細胞。五、實驗結(jié)果及分析（一）酵母菌的形態(tài)觀察1、美蘭染色后，觀察到視野中細胞呈圓形或橢圓形，人部分呈白色，少部分呈藍色。可見芽殖，較人

的母體細胞旁邊有一較小的芽體，母體細胞白色，芽體淺藍色。而在子囊泡子的觀察中，可見四個呈菱形的子囊范子靠在一起，相互之間以及范子于壞境之間都有透明的子囊壁隔開。芽殖和子囊施子如下圖1所示。2、假菌絲的觀察（-）顯微鏡下的細胞計數(shù)將計得菌數(shù)填入卞表2。表2釀酒酵母的血球計數(shù)板計數(shù)格數(shù)123456789平均數(shù)數(shù)目5665765345375根據(jù)公式，計算所得單位體枳的菌數(shù)如卜?:

每亳升的菌數(shù)（個）=平均每個中方格內(nèi)的菌數(shù)16X桶釋倍數(shù)X4000X10005.37516每亳升的菌數(shù)（個）=平均每個中方格內(nèi)的菌數(shù)16X桶釋倍數(shù)X4000X10005.37516（三）顯微鏡卞細胞人小的測量1、目鏡測微尺的校正結(jié)果表2目鏡測微尺刻度的校正物鏡物鏡倍數(shù)目鏡測微尺格數(shù)鏡臺測微尺格數(shù)目鏡測微尺每格代表的長（pm）高倍鏡402052.52、測量結(jié)果表3釀酒酵母細胞人小的測量菌細胞編號123456目鏡測微尺格數(shù)（長軸）4.34.34.53.24.65.2目鏡測微尺格數(shù)（短軸）4.34.12.52.74.13.6菌體大?。╱m*um）115.6110.270.354.0117.9117.0菌細胞編號78910平均數(shù)目鏡測微尺格數(shù)（長軸）4.54.94.14.94.4目鏡測微尺格數(shù)（短軸）1.82.52.72.83.6菌體大?。╱m*um）50.676.669.285.896.5由上表可知，釀酒酵母細胞平均人小為4?4X3?6pm,而細胞的人小范圉是（3?2~5?2）X（2?8~4?3）屮m3、班級數(shù)據(jù)匯總：3.1釀酒酵母的血球計數(shù)板計數(shù)(EB藝昱=込0&0_(EB藝昱=込0&0_denistyMin.:1750001stQu.:1087500Median:1500000Mean:38399583rdQU.:3527778Max.:39444444

3.2釀酒酵母細胞人小的測量描述性統(tǒng)汁結(jié)果:ID_O長鞘ID_O長鞘Min.:3.3101stQu.:6.362Median:9.100Mean:8.2803rdQU.:10.012Max.:16.200短軸Min.:1.6101stQu.:3.975Median:5.885Mean:5.4853rdQU.:7.135Max.:11.900長軸短軸酵母細胞大小測量六、思考題用美蘭染色時，如何在光學(xué)顯微鏡下區(qū)分酵母細胞代謝活性的強弱？用光學(xué)顯微鏡觀察酵母菌體時，其在制片和染色方面與細菌有何差別？為什么說熱帶假絲酵母的菌絲是假菌絲？七、總結(jié)1＞制備待計數(shù)菌懸液時，為避免無菌水中菌體密