第五章 生物制品制造新技術(shù)

第五章生物制品制造新技術(shù)教學(xué)目的與要求掌握基因工程疫苗的原理，了解基因工程疫苗的概念與進(jìn)展。了解生物技術(shù)診斷制劑，掌握這些生物技術(shù)診斷制劑的原理了解抗體工程的種類(lèi)。Introduction疫苗技術(shù)的3個(gè)階段：第一次革命：經(jīng)典的微生物疫苗時(shí)代：19世紀(jì)到20世紀(jì)第二次革命：20世紀(jì)70年代生物技術(shù)的出現(xiàn)：重組DNA技術(shù)為代表的基因工程疫苗時(shí)代第三次革命：20世紀(jì)90年代的DNA疫苗時(shí)代重組DNA技術(shù)產(chǎn)生基因工程疫苗：重組亞單位疫苗、活載體疫苗、基因缺失疫苗和DNA疫苗等疫苗；生物技術(shù)診斷抗原制劑，如基因工程抗原、核酸探針、PCR和基因芯片等的制造新技術(shù)，抗體工程技術(shù)。治療性疫苗、腫瘤疫苗和生理調(diào)控疫苗等。反向遺傳學(xué)疫苗研制途徑。第一節(jié)、基因工程疫苗基因工程疫苗：指用重組DNA技術(shù)研制的疫苗。重組亞單位疫苗、活載體苗、基因缺失疫苗，裸露DNA疫苗等。新途徑，新希望，受到重視。一、重組亞單位疫苗（recombinantsubunitvaccines)

用DNA重組技術(shù)，將編碼病原微生物保護(hù)性抗原的基因?qū)朐嘶蛘婧思?xì)胞，使其在受體細(xì)胞中高效表達(dá)，分泌保護(hù)性抗原肽鏈。提取保護(hù)性抗原肽鏈，加入佐劑即制成生物制品，叫基因工程重組亞單位疫苗。原理選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)PCR擴(kuò)增保護(hù)性抗原的基因重組DNA：把抗原的基因亞克隆到表達(dá)載體重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入系統(tǒng)的宿主細(xì)胞鑒定和選擇表達(dá)所需細(xì)胞培養(yǎng)繁殖制備疫苗生產(chǎn)重組亞單位疫苗的表達(dá)系統(tǒng)：原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸埃希氏菌（E.coli）和枯草桿菌（Bacillussubtilis）表達(dá)系統(tǒng)。（最常用），其他如：鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)等真核表達(dá)系統(tǒng)：如酵母表達(dá)系統(tǒng)；昆蟲(chóng)基因表達(dá)系統(tǒng)；絲狀真菌基因表達(dá)系統(tǒng)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)植物表達(dá)系統(tǒng)參考：基因工程原理。重組亞單位疫苗的優(yōu)點(diǎn)：安全性好，無(wú)感染，可用于不宜使用活疫苗動(dòng)物，如妊娠動(dòng)物。減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以避免的熱原、變應(yīng)原、免疫抑制原和其它有害的反應(yīng)原。穩(wěn)定性好，便于保存和運(yùn)輸，可與感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答相區(qū)別，適合疫病的控制和消滅計(jì)劃。成功例案：首次：口蹄疫基因工程亞單位疫苗；人乙型肝炎基因工程亞單位疫苗，廣泛應(yīng)用。預(yù)防仔豬和犢牛下痢的大腸桿菌菌毛基因工程重組亞單位疫苗。二、重組活載體疫苗（live,vectoredvaccines)定義：用基因工程技術(shù)將保護(hù)性抗原基因（目的基因）轉(zhuǎn)移到載體中使之表達(dá)的活疫苗。分類(lèi)：重組載體病毒活疫苗、重組載體細(xì)菌活疫苗細(xì)菌載體，沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等；病毒載體：痘病毒，腺病毒和皰疹病毒等。例子：國(guó)外：腺病毒為載體的乙肝疫苗、以皰疹病毒為載體的新城疫疫苗等。優(yōu)點(diǎn)：活載體疫苗具有傳統(tǒng)疫苗的許多優(yōu)點(diǎn)，而且又為多價(jià)苗和聯(lián)苗的生產(chǎn)開(kāi)辟了新路，是當(dāng)今與未來(lái)疫苗研制與開(kāi)發(fā)的主要方向之一。

(非復(fù)制性疫苗，又稱(chēng)活-死疫苗：與重組活載體疫苗類(lèi)似，但載體病毒接種后只產(chǎn)生頓挫感染，不能完成復(fù)制過(guò)程，無(wú)排毒的隱患，同時(shí)又可表達(dá)目的抗原，產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。如用金絲雀痘病毒為載體，表達(dá)新城疫病毒HF基因，用于預(yù)防雞的新城疫。)重組活載體主要包括病毒、細(xì)菌，詳見(jiàn)表5.1。（一）重組載體病毒活疫苗

病毒載體兩種：A：復(fù)制缺陷性載體病毒，只有通過(guò)特定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的互補(bǔ)作用或通過(guò)輔助病毒疊加感染才能產(chǎn)生傳染性后代；B：具有復(fù)制能力的病毒，如皰疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作為外源基因的載體而保持其傳染性。例子：利用雞痘病毒為載體，國(guó)內(nèi)外已成功表達(dá)了流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克氏病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒、狂犬病病毒、傳染性支氣管炎病毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美爾球蟲(chóng)等的保護(hù)性抗原基因，其中部分產(chǎn)品已正式注冊(cè)。圖5.1概括了重組病毒活載體構(gòu)建策略與原理。（二）重組載體細(xì)菌活疫苗

優(yōu)點(diǎn)：細(xì)菌載體本身起佐劑作用，刺激產(chǎn)生強(qiáng)的B細(xì)胞和T細(xì)胞免疫應(yīng)答?？诜抽T(mén)氏菌疫苗還能刺激黏膜免疫，如把志賀氏菌、霍亂弧菌和大腸埃希氏菌的抗原基因?qū)肷抽T(mén)氏菌表達(dá)。研究少，涉及細(xì)菌多基因，較困難，如細(xì)菌外膜其他結(jié)構(gòu)：黏附分子侵襲蛋白和鞭毛脂多糖等復(fù)雜，如LPS表達(dá)涉及30多個(gè)基因的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。代表：疫苗株沙門(mén)氏菌、李斯特氏菌和卡介苗、痢疾菌等。三、基因缺失疫苗（genedeletedvaccines)定義：用基因工程技術(shù)將強(qiáng)毒株毒力相關(guān)基因切除構(gòu)建的活疫苗。該技術(shù)策略如下圖基因缺失疫苗優(yōu)點(diǎn)：安全性好、不易返祖；免疫力堅(jiān)實(shí)，免疫期長(zhǎng)，適于局部接種，誘導(dǎo)產(chǎn)生黏膜免疫力。例子：如霍亂弧菌苗；大腸桿菌苗；偽狂犬病毒基因缺失疫苗四、基因疫苗（geneticvaccines)包括DNA疫苗和RNA疫苗，由編碼能引起保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原的基因片段和載體構(gòu)建而成?；蛞呙缪兄频幕静襟E是：①目的基因的分析；②選擇合適的表達(dá)載體；③測(cè)序確認(rèn)編碼序列；④體外轉(zhuǎn)錄／翻譯驗(yàn)證試驗(yàn)；⑤動(dòng)物試驗(yàn)；⑥結(jié)果評(píng)價(jià)等。

顧慮:是否與細(xì)胞染色體組整合，抗DNA免疫反應(yīng)的可能影響；免疫耐受；免疫效力如何進(jìn)一步提高等。五、多肽疫苗（peptidevaccines)定義：用化學(xué)合成法或基因工程手段合成病原微生物的保護(hù)性多肽或表位并將其連接到大分子載體上，再加入佐劑制成的疫苗。優(yōu)點(diǎn)：可在同一載體上連接多種保護(hù)性肽鏈或多個(gè)血清型的保護(hù)性抗原肽鏈，一次免疫就可防幾種傳染病。例子：最早報(bào)道（1982)成功的是口蹄疫多肽疫苗，還有乙型肝炎和瘧疾合成肽疫苗。六、轉(zhuǎn)基因植物疫苗（transgenicplantvaccine)又稱(chēng)為食用疫苗（ediblevaccine）

兩種表達(dá)系統(tǒng)：整合表達(dá)系統(tǒng)，把編碼病原體保護(hù)性抗原基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，并整合到植物細(xì)胞染色體上，整合了外源基因的植物細(xì)胞在一定條件下生長(zhǎng)成新的植株。這些植株在生長(zhǎng)過(guò)程中可表達(dá)出疫苗抗原，并把這種性狀遺傳給子代，形成表達(dá)疫苗的植物品系。瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，利用重組植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原的基因插入植物病毒基因組中，再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內(nèi)復(fù)制、裝配并高效表達(dá)。第二節(jié)、生物技術(shù)診斷制劑包括：1、重組表達(dá)抗原(recombinantantigen)2、核酸探針（nucleicacidprobe,geneprobe）、3、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）4、基因芯片（DNAchip）等。

特點(diǎn)：特異性強(qiáng)，可獲得常規(guī)方法無(wú)法制備的一些診斷制劑，易于標(biāo)準(zhǔn)化、產(chǎn)業(yè)化。一、重組表達(dá)抗原重組表達(dá)抗原：是用DNA重組技術(shù)，將編碼特定抗原的基因插入原核或真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中使其高效表達(dá)，分離純化產(chǎn)物制造成重組表達(dá)抗原。優(yōu)點(diǎn)：高特異性、高純度、均質(zhì)性好、重復(fù)性強(qiáng)、成本較低，可大批量生產(chǎn)等；可獲得常規(guī)方法無(wú)法制備的診斷抗原；也可以獲得對(duì)人獸共患病特別是高危險(xiǎn)病原體（如免疫缺陷病毒、結(jié)核分枝桿菌、炭疽桿菌等）的診斷抗原。例子：已制備出標(biāo)準(zhǔn)的乙型肝炎各組分診斷抗原。發(fā)展前景看好。二、核酸圖譜分析核酸酶切圖譜寡核苷酸指紋圖譜等。核酸電泳圖譜（一）核酸電泳圖譜分析指分離純化的核酸，因其相對(duì)分子質(zhì)量的差異而在電泳中具有不同的遷移速率并形成不同的帶型。通過(guò)帶型異同度的分析可確定生物體間的遺傳關(guān)系（兩種）1．質(zhì)粒圖譜分析：質(zhì)粒是耐藥性、毒力因子等特殊遺傳特性的載體。多數(shù)細(xì)菌往往含有大小和數(shù)量不等的質(zhì)粒，具有相對(duì)穩(wěn)定性，質(zhì)粒圖譜分析是細(xì)菌分型和流行病學(xué)調(diào)查的重要工具，具有診斷價(jià)值。

優(yōu)點(diǎn)：該法簡(jiǎn)便、特異、快速、可靠，缺點(diǎn)：對(duì)一些無(wú)質(zhì)粒或質(zhì)粒不穩(wěn)定的菌株，以及質(zhì)粒相對(duì)分子質(zhì)量相同而核苷酸序列不同的菌株無(wú)分辨能力。2.RNA電泳圖譜分析：分節(jié)段RNA病毒的電泳圖譜分析常用。根據(jù)不同RNA片段相對(duì)分子質(zhì)量具有一定差異，在PAGE電泳中的遷移速率有所不同，染色后顯示出不同的電泳圖譜，因而可對(duì)不同的病毒或相同病毒不同毒株的基因組加以分析比較。（二）核酸酶切圖譜分析生物的cDNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的不同片段，瓊脂糖電泳后可形成不同的帶型，即核酸酶切圖譜，又稱(chēng)DNA指紋圖譜。用相同的限制性內(nèi)切酶消化的DNA所產(chǎn)生片段的異同程度，直接反映生物體間的遺傳關(guān)系。用不同的限制性內(nèi)切酶消化DNA可分析基因間的連鎖關(guān)系。用于比較不同病原體基因組的差異，了解它們之間遺傳關(guān)系。限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)分析（RFLP）是其中一種。（三）寡核苷酸指紋圖譜分析將純化的RNA經(jīng)一種特殊的RNA酶（通常為T(mén)1酶）消化后，產(chǎn)生許多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠雙相電泳分離后進(jìn)行放射自顯影，形成一類(lèi)似指紋的圖譜，即寡核苷酸指紋圖譜。用于RNA病毒的研究，如基因組遺傳多樣性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、歷史演變和宿主類(lèi)群關(guān)系的研究，野毒株與疫苗株的比較等。三、核酸探針：放射性同位素、地高辛或生物素等標(biāo)記核酸分子或其片段的一條鏈作為核酸探針，與處理樣本中存在的互補(bǔ)鏈結(jié)合為雙鏈，這個(gè)反應(yīng)就稱(chēng)為核酸雜交或分子雜交。分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交。根據(jù)方法不同，又分為原位雜交和轉(zhuǎn)印雜交。在轉(zhuǎn)印雜交中，檢測(cè)DNA的稱(chēng)為Southern雜交，檢測(cè)RNA稱(chēng)為Northern雜交。廣泛用于特定基因的檢測(cè)和基因轉(zhuǎn)錄活性的研究。四、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)PCR技術(shù)是簡(jiǎn)便、一快速、特異、敏感的檢測(cè)手段，適于檢測(cè)不宜分離培養(yǎng)或含量極微的樣品中病原體，或分析不同樣品中基因片段的異同。PCR與酶切圖譜分析和分子雜交技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用可獲得更好的效果。種類(lèi)：如（RT-PCR)、熒光PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR等。五、基因芯片DNA芯片（DNAchip),DNA微陣列（DNAmicroarray)、寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip)指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測(cè)的標(biāo)記樣品中的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)作出比較和檢測(cè)。20世紀(jì)90年代初，美國(guó)Fodor博士提出并研究。用于基因表達(dá)譜分析、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因突變與多態(tài)性分析、基因組文庫(kù)作圖、疾病的診斷與預(yù)測(cè)、藥物篩選，以及司法與刑偵、環(huán)境與食品衛(wèi)生監(jiān)督等。六、其它技術(shù)核苷酸序列分析、多位點(diǎn)酶電泳等。

第三節(jié)、抗體工程技術(shù)多克隆抗體

(Polyclonalantibody)一.概念給動(dòng)物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細(xì)胞增殖分化所產(chǎn)生的,稱(chēng)為多克隆抗體。二.多克隆抗體的應(yīng)用免疫學(xué)檢測(cè)被動(dòng)免疫治療和緊急預(yù)防三.存在問(wèn)題特異性差,用于免疫學(xué)檢測(cè)容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)

單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)一、單抗概念:通過(guò)B細(xì)胞雜交瘤技術(shù),獲得特異性針對(duì)某一種抗原決定簇的細(xì)胞克隆，產(chǎn)生均一性的抗體。

二、B細(xì)胞雜交瘤的類(lèi)型

小鼠-小鼠大鼠-大鼠小鼠-人人-人

1975年Kohler和Milstein建立體外淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，1984年獲得諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。三、單抗與多抗區(qū)別如圖：5.2。四、單抗的制備（一）淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)：（lymphocytehybridomatechnology)。將經(jīng)預(yù)定抗原免疫的淋巴細(xì)胞與失去次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶(TK）合成能力的骨髓瘤細(xì)胞系細(xì)胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)、篩選或克隆化，獲得既能分泌針對(duì)預(yù)定抗原的單抗又有無(wú)限制增殖能力的雜交瘤細(xì)胞系。（二）雜交瘤技術(shù)的原理

1.親本細(xì)胞的選擇

小鼠骨髓瘤細(xì)胞:次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷型

免疫脾細(xì)胞:來(lái)自經(jīng)抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟（B細(xì)胞）2.細(xì)胞融合骨髓瘤細(xì)胞

脾細(xì)胞融合后細(xì)胞的類(lèi)型:

未融合的脾細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞未融合的瘤細(xì)胞細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞

PEG

3雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：糖+氨基酸氨基喋呤(Aminopterin,A)TK核苷酸DNA

胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)核苷酸前體HGPRT

次黃嘌呤IMP(Hypoxanthine,H)融合后細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細(xì)胞（HGPRT+,TK+,不能長(zhǎng)期生長(zhǎng)）骨髓瘤細(xì)胞（HGPRT-,TK-，不能生長(zhǎng)）雜交瘤細(xì)胞（HGPRT+,TK+，能夠生長(zhǎng)）4.雜交瘤細(xì)胞的篩選和克隆化

篩選：免疫熒光ELISA等克隆化：有限稀釋法單個(gè)細(xì)胞顯微操作法軟瓊脂培養(yǎng)法5.單克隆抗體的生產(chǎn)

體內(nèi)：BALB/c小鼠體內(nèi)誘發(fā)含有單抗的腹水體外：無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等6.單克隆抗體的純化

硫酸銨沉淀法離子交換層析A蛋白-Sepharose親和層析（三）操作步驟見(jiàn)下圖：1.B細(xì)胞的制備：純Ag免疫小鼠2-3次，間隔2-4周，最后一次免疫結(jié)束后3-4天取其脾臟，制成108/mL的脾細(xì)胞懸液。2．骨髓瘤細(xì)胞的制備：小鼠骨髓瘤細(xì)胞，如SP2/0或NS-1具有營(yíng)養(yǎng)缺陷（缺少次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶），不能在HAT培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。在10％新生犢牛血清的DMEM中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)達(dá)105-106/mL，即可。3．飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備小鼠胸腺細(xì)胞、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作用：減少培養(yǎng)板對(duì)雜交瘤細(xì)胞的毒性，清除一部分死亡的細(xì)胞。在融合前，將飼養(yǎng)細(xì)胞制成所需的濃度加入培養(yǎng)孔中。4.HAT選擇培養(yǎng)基