第五章 生物制品制造新技術

第五章生物制品制造新技術教學目的與要求掌握基因工程疫苗的原理，了解基因工程疫苗的概念與進展。了解生物技術診斷制劑，掌握這些生物技術診斷制劑的原理了解抗體工程的種類。Introduction疫苗技術的3個階段：第一次革命：經典的微生物疫苗時代：19世紀到20世紀第二次革命：20世紀70年代生物技術的出現：重組DNA技術為代表的基因工程疫苗時代第三次革命：20世紀90年代的DNA疫苗時代重組DNA技術產生基因工程疫苗：重組亞單位疫苗、活載體疫苗、基因缺失疫苗和DNA疫苗等疫苗；生物技術診斷抗原制劑，如基因工程抗原、核酸探針、PCR和基因芯片等的制造新技術，抗體工程技術。治療性疫苗、腫瘤疫苗和生理調控疫苗等。反向遺傳學疫苗研制途徑。第一節(jié)、基因工程疫苗基因工程疫苗：指用重組DNA技術研制的疫苗。重組亞單位疫苗、活載體苗、基因缺失疫苗，裸露DNA疫苗等。新途徑，新希望，受到重視。一、重組亞單位疫苗（recombinantsubunitvaccines)

用DNA重組技術，將編碼病原微生物保護性抗原的基因導入原核或真核細胞，使其在受體細胞中高效表達，分泌保護性抗原肽鏈。提取保護性抗原肽鏈，加入佐劑即制成生物制品，叫基因工程重組亞單位疫苗。原理選擇合適的表達系統PCR擴增保護性抗原的基因重組DNA：把抗原的基因亞克隆到表達載體重組表達質粒導入系統的宿主細胞鑒定和選擇表達所需細胞培養(yǎng)繁殖制備疫苗生產重組亞單位疫苗的表達系統：原核表達系統：大腸埃希氏菌（E.coli）和枯草桿菌（Bacillussubtilis）表達系統。（最常用），其他如：鏈霉菌基因表達系統等真核表達系統：如酵母表達系統；昆蟲基因表達系統；絲狀真菌基因表達系統；哺乳動物細胞表達系統植物表達系統參考：基因工程原理。重組亞單位疫苗的優(yōu)點：安全性好，無感染，可用于不宜使用活疫苗動物，如妊娠動物。減少或消除了常規(guī)活疫苗或死疫苗難以避免的熱原、變應原、免疫抑制原和其它有害的反應原。穩(wěn)定性好，便于保存和運輸，可與感染產生的免疫應答相區(qū)別，適合疫病的控制和消滅計劃。成功例案：首次：口蹄疫基因工程亞單位疫苗；人乙型肝炎基因工程亞單位疫苗，廣泛應用。預防仔豬和犢牛下痢的大腸桿菌菌毛基因工程重組亞單位疫苗。二、重組活載體疫苗（live,vectoredvaccines)定義：用基因工程技術將保護性抗原基因（目的基因）轉移到載體中使之表達的活疫苗。分類：重組載體病毒活疫苗、重組載體細菌活疫苗細菌載體，沙門氏菌、大腸桿菌等；病毒載體：痘病毒，腺病毒和皰疹病毒等。例子：國外：腺病毒為載體的乙肝疫苗、以皰疹病毒為載體的新城疫疫苗等。優(yōu)點：活載體疫苗具有傳統疫苗的許多優(yōu)點，而且又為多價苗和聯苗的生產開辟了新路，是當今與未來疫苗研制與開發(fā)的主要方向之一。

(非復制性疫苗，又稱活-死疫苗：與重組活載體疫苗類似，但載體病毒接種后只產生頓挫感染，不能完成復制過程，無排毒的隱患，同時又可表達目的抗原，產生有效的免疫保護。如用金絲雀痘病毒為載體，表達新城疫病毒HF基因，用于預防雞的新城疫。)重組活載體主要包括病毒、細菌，詳見表5.1。（一）重組載體病毒活疫苗

病毒載體兩種：A：復制缺陷性載體病毒，只有通過特定轉化細胞的互補作用或通過輔助病毒疊加感染才能產生傳染性后代；B：具有復制能力的病毒，如皰疹病毒、腺病毒和痘病毒都可作為外源基因的載體而保持其傳染性。例子：利用雞痘病毒為載體，國內外已成功表達了流感病毒、新城疫病毒、傳染性法氏囊病病毒、馬立克氏病病毒、禽網狀內皮組織增生癥病毒、狂犬病病毒、傳染性支氣管炎病毒、麻疹病毒、猿猴免疫缺陷病毒、艾美爾球蟲等的保護性抗原基因，其中部分產品已正式注冊。圖5.1概括了重組病毒活載體構建策略與原理。（二）重組載體細菌活疫苗

優(yōu)點：細菌載體本身起佐劑作用，刺激產生強的B細胞和T細胞免疫應答?？诜抽T氏菌疫苗還能刺激黏膜免疫，如把志賀氏菌、霍亂弧菌和大腸埃希氏菌的抗原基因導入沙門氏菌表達。研究少，涉及細菌多基因，較困難，如細菌外膜其他結構：黏附分子侵襲蛋白和鞭毛脂多糖等復雜，如LPS表達涉及30多個基因的級聯反應。代表：疫苗株沙門氏菌、李斯特氏菌和卡介苗、痢疾菌等。三、基因缺失疫苗（genedeletedvaccines)定義：用基因工程技術將強毒株毒力相關基因切除構建的活疫苗。該技術策略如下圖基因缺失疫苗優(yōu)點：安全性好、不易返祖；免疫力堅實，免疫期長，適于局部接種，誘導產生黏膜免疫力。例子：如霍亂弧菌苗；大腸桿菌苗；偽狂犬病毒基因缺失疫苗四、基因疫苗（geneticvaccines)包括DNA疫苗和RNA疫苗，由編碼能引起保護性免疫反應的病原體抗原的基因片段和載體構建而成?；蛞呙缪兄频幕静襟E是：①目的基因的分析；②選擇合適的表達載體；③測序確認編碼序列；④體外轉錄／翻譯驗證試驗；⑤動物試驗；⑥結果評價等。

顧慮:是否與細胞染色體組整合，抗DNA免疫反應的可能影響；免疫耐受；免疫效力如何進一步提高等。五、多肽疫苗（peptidevaccines)定義：用化學合成法或基因工程手段合成病原微生物的保護性多肽或表位并將其連接到大分子載體上，再加入佐劑制成的疫苗。優(yōu)點：可在同一載體上連接多種保護性肽鏈或多個血清型的保護性抗原肽鏈，一次免疫就可防幾種傳染病。例子：最早報道（1982)成功的是口蹄疫多肽疫苗，還有乙型肝炎和瘧疾合成肽疫苗。六、轉基因植物疫苗（transgenicplantvaccine)又稱為食用疫苗（ediblevaccine）

兩種表達系統：整合表達系統，把編碼病原體保護性抗原基因導入植物細胞內，并整合到植物細胞染色體上，整合了外源基因的植物細胞在一定條件下生長成新的植株。這些植株在生長過程中可表達出疫苗抗原，并把這種性狀遺傳給子代，形成表達疫苗的植物品系。瞬時表達系統，利用重組植物病毒為載體，將編碼疫苗抗原的基因插入植物病毒基因組中，再用此重組病毒感染植物，抗原基因隨病毒在植物體內復制、裝配并高效表達。第二節(jié)、生物技術診斷制劑包括：1、重組表達抗原(recombinantantigen)2、核酸探針（nucleicacidprobe,geneprobe）、3、聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction,PCR）4、基因芯片（DNAchip）等。

特點：特異性強，可獲得常規(guī)方法無法制備的一些診斷制劑，易于標準化、產業(yè)化。一、重組表達抗原重組表達抗原：是用DNA重組技術，將編碼特定抗原的基因插入原核或真核表達質粒，轉入宿主細胞中使其高效表達，分離純化產物制造成重組表達抗原。優(yōu)點：高特異性、高純度、均質性好、重復性強、成本較低，可大批量生產等；可獲得常規(guī)方法無法制備的診斷抗原；也可以獲得對人獸共患病特別是高危險病原體（如免疫缺陷病毒、結核分枝桿菌、炭疽桿菌等）的診斷抗原。例子：已制備出標準的乙型肝炎各組分診斷抗原。發(fā)展前景看好。二、核酸圖譜分析核酸酶切圖譜寡核苷酸指紋圖譜等。核酸電泳圖譜（一）核酸電泳圖譜分析指分離純化的核酸，因其相對分子質量的差異而在電泳中具有不同的遷移速率并形成不同的帶型。通過帶型異同度的分析可確定生物體間的遺傳關系（兩種）1．質粒圖譜分析：質粒是耐藥性、毒力因子等特殊遺傳特性的載體。多數細菌往往含有大小和數量不等的質粒，具有相對穩(wěn)定性，質粒圖譜分析是細菌分型和流行病學調查的重要工具，具有診斷價值。

優(yōu)點：該法簡便、特異、快速、可靠，缺點：對一些無質粒或質粒不穩(wěn)定的菌株，以及質粒相對分子質量相同而核苷酸序列不同的菌株無分辨能力。2.RNA電泳圖譜分析：分節(jié)段RNA病毒的電泳圖譜分析常用。根據不同RNA片段相對分子質量具有一定差異，在PAGE電泳中的遷移速率有所不同，染色后顯示出不同的電泳圖譜，因而可對不同的病毒或相同病毒不同毒株的基因組加以分析比較。（二）核酸酶切圖譜分析生物的cDNA，經限制性內切酶切割產生的不同片段，瓊脂糖電泳后可形成不同的帶型，即核酸酶切圖譜，又稱DNA指紋圖譜。用相同的限制性內切酶消化的DNA所產生片段的異同程度，直接反映生物體間的遺傳關系。用不同的限制性內切酶消化DNA可分析基因間的連鎖關系。用于比較不同病原體基因組的差異，了解它們之間遺傳關系。限制性酶切片段長度多態(tài)分析（RFLP）是其中一種。（三）寡核苷酸指紋圖譜分析將純化的RNA經一種特殊的RNA酶（通常為T1酶）消化后，產生許多理化特性和大小不同的寡核苷酸片段，經聚丙烯酰胺凝膠雙相電泳分離后進行放射自顯影，形成一類似指紋的圖譜，即寡核苷酸指紋圖譜。用于RNA病毒的研究，如基因組遺傳多樣性研究，同一病毒不同毒株的地理分布、歷史演變和宿主類群關系的研究，野毒株與疫苗株的比較等。三、核酸探針：放射性同位素、地高辛或生物素等標記核酸分子或其片段的一條鏈作為核酸探針，與處理樣本中存在的互補鏈結合為雙鏈，這個反應就稱為核酸雜交或分子雜交。分為DNA-DNA雜交、DNA-RNA雜交、RNA-RNA雜交。根據方法不同，又分為原位雜交和轉印雜交。在轉印雜交中，檢測DNA的稱為Southern雜交，檢測RNA稱為Northern雜交。廣泛用于特定基因的檢測和基因轉錄活性的研究。四、聚合酶鏈反應（PCR)PCR技術是簡便、一快速、特異、敏感的檢測手段，適于檢測不宜分離培養(yǎng)或含量極微的樣品中病原體，或分析不同樣品中基因片段的異同。PCR與酶切圖譜分析和分子雜交技術聯合應用可獲得更好的效果。種類：如（RT-PCR)、熒光PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR等。五、基因芯片DNA芯片（DNAchip),DNA微陣列（DNAmicroarray)、寡核苷酸微芯片（oligonucleotidemicrochip)指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品中的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統等對芯片進行掃描，并配以計算機系統對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測。20世紀90年代初，美國Fodor博士提出并研究。用于基因表達譜分析、新基因的發(fā)現、基因突變與多態(tài)性分析、基因組文庫作圖、疾病的診斷與預測、藥物篩選，以及司法與刑偵、環(huán)境與食品衛(wèi)生監(jiān)督等。六、其它技術核苷酸序列分析、多位點酶電泳等。

第三節(jié)、抗體工程技術多克隆抗體

(Polyclonalantibody)一.概念給動物接種抗原所獲得的免疫血清或抗血清是多種抗體的混合物,它是由多種抗原決定簇刺激多株B細胞增殖分化所產生的,稱為多克隆抗體。二.多克隆抗體的應用免疫學檢測被動免疫治療和緊急預防三.存在問題特異性差,用于免疫學檢測容易出現交叉反應

單克隆抗體

(Monoclonalantibody,McAb)一、單抗概念:通過B細胞雜交瘤技術,獲得特異性針對某一種抗原決定簇的細胞克隆，產生均一性的抗體。

二、B細胞雜交瘤的類型

小鼠-小鼠大鼠-大鼠小鼠-人人-人

1975年Kohler和Milstein建立體外淋巴細胞雜交瘤技術，1984年獲得諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。三、單抗與多抗區(qū)別如圖：5.2。四、單抗的制備（一）淋巴細胞雜交瘤技術：（lymphocytehybridomatechnology)。將經預定抗原免疫的淋巴細胞與失去次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶(TK）合成能力的骨髓瘤細胞系細胞融合，產生雜交瘤細胞，經過培養(yǎng)、篩選或克隆化，獲得既能分泌針對預定抗原的單抗又有無限制增殖能力的雜交瘤細胞系。（二）雜交瘤技術的原理

1.親本細胞的選擇

小鼠骨髓瘤細胞:次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶(HGPRT)缺陷型

免疫脾細胞:來自經抗原免疫的BALB/c小鼠的脾臟（B細胞）2.細胞融合骨髓瘤細胞

脾細胞融合后細胞的類型:

未融合的脾細胞雜交瘤細胞未融合的瘤細胞細胞融合雜交瘤細胞

PEG

3雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)DNA合成的途徑：糖+氨基酸氨基喋呤(Aminopterin,A)TK核苷酸DNA

胸腺嘧啶核苷TMP(Thymidine,T)核苷酸前體HGPRT

次黃嘌呤IMP(Hypoxanthine,H)融合后細胞在HAT培養(yǎng)基中存活情況脾細胞（HGPRT+,TK+,不能長期生長）骨髓瘤細胞（HGPRT-,TK-，不能生長）雜交瘤細胞（HGPRT+,TK+，能夠生長）4.雜交瘤細胞的篩選和克隆化

篩選：免疫熒光ELISA等克隆化：有限稀釋法單個細胞顯微操作法軟瓊脂培養(yǎng)法5.單克隆抗體的生產

體內：BALB/c小鼠體內誘發(fā)含有單抗的腹水體外：無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)等6.單克隆抗體的純化

硫酸銨沉淀法離子交換層析A蛋白-Sepharose親和層析（三）操作步驟見下圖：1.B細胞的制備：純Ag免疫小鼠2-3次，間隔2-4周，最后一次免疫結束后3-4天取其脾臟，制成108/mL的脾細胞懸液。2．骨髓瘤細胞的制備：小鼠骨髓瘤細胞，如SP2/0或NS-1具有營養(yǎng)缺陷（缺少次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶），不能在HAT培養(yǎng)基上生長。在10％新生犢牛血清的DMEM中培養(yǎng)至對數生長期，細胞數達105-106/mL，即可。3．飼養(yǎng)細胞準備小鼠胸腺細胞、小鼠腹腔巨噬細胞作用：減少培養(yǎng)板對雜交瘤細胞的毒性，清除一部分死亡的細胞。在融合前，將飼養(yǎng)細胞制成所需的濃度加入培養(yǎng)孔中。4.HAT選擇培養(yǎng)基