第八章 現(xiàn)代酶工程技術(shù)

酶工程又稱酶生物技術(shù)，是酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)。酶工程的主要內(nèi)容包括：酶的生產(chǎn)，酶活力測定，酶和細(xì)胞的固定化，酶反應(yīng)器，酶的應(yīng)用等。第八章現(xiàn)代酶工程技術(shù)

1998年全世界工業(yè)酶制劑銷售額為16億美元，預(yù)到2008年將達(dá)到30億美元。酶的生產(chǎn)方法可歸納為提取法、發(fā)酵法和化學(xué)合成法三種。其中，提取法是最早采用而沿用至今的方法。發(fā)酵法是20世紀(jì)50年代以來酶生產(chǎn)的主要方法。而化學(xué)合成法仍處在實(shí)驗(yàn)室階段。一、酶的生產(chǎn)提取法是最早采用的酶生產(chǎn)方法。它是采用各種提取、分離技術(shù)從動(dòng)物、植物或微生物細(xì)胞或組織中將酶提取分離出來。提取法簡單方便，如從木瓜中提取木瓜蛋白酶；從菠蘿皮中提取菠蘿蛋白酶；大蒜蒜瓣細(xì)胞中提取SOD等。1．提取法在大蒜蒜瓣細(xì)胞中含有較豐富的SOD，通過組織或細(xì)胞破碎后，可用7．8的磷酸緩沖液提?。禾崛∫河玫蜐舛鹊穆确隆掖继幚恚x心后去除雜蛋白沉淀，得SOD粗酶液，由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮將其沉淀析出。

SOD提取它是利用微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)而獲得人們所需的酶。

固體培養(yǎng)發(fā)酵法一般采用麩皮或米糠為主要原料，加水拌成含水量適度的半固態(tài)物料作為培養(yǎng)基供微生物繁殖和產(chǎn)酶。

液體深層發(fā)酵法是以液態(tài)培養(yǎng)基，置于發(fā)酵容器內(nèi)，經(jīng)滅菌、冷卻后接入產(chǎn)酶細(xì)胞，在一定條件下進(jìn)行發(fā)酵。2．發(fā)酵法化學(xué)合成法是20世紀(jì)60年代中期出現(xiàn)的新技術(shù)。1965年，我國人工合成胰島素的成功，開辟了蛋白質(zhì)化學(xué)合成的新紀(jì)元。1969年，美國首次用化學(xué)合成法得到含有124個(gè)氨基酸的核糖核酸酶。然而由于酶的化學(xué)合成要求作為單體底物的各種氨基酸達(dá)到很高的純度；合成的成本高昂,這就使化學(xué)合成法受到限制，至今并未應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。3．化學(xué)合成法在酶的生產(chǎn)及應(yīng)用過程中，經(jīng)常要進(jìn)行酶的活力測定，以確定酶量的多少及其變化情況。酶活力是指在一定條件下，酶所催化的反應(yīng)速度。反應(yīng)速度越大，表明酶活力越高。二、酶的活力測定

1961年國際生化聯(lián)合會(huì)規(guī)定：在特定條件下（溫度、pH值等條件均采用最適條件），每1min催化1μmol的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量定義為1個(gè)活力單位。這個(gè)單位稱為酶的國際單位（IU）。如糖化酶活力測定時(shí)，在pH4.6，溫度為40℃的條件下，每1min催化可溶性淀粉水解生成1μmol葡萄糖的酶量定義為1個(gè)活力單位。酶活力單位

SOD活力測定鄰苯三酚它在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出，生成帶色的中間產(chǎn)物。反應(yīng)開始后，反應(yīng)液變成黃棕色，顏色逐漸加深，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)果。鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段顏色與時(shí)間成線性關(guān)系。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間物的積累，因此，通過計(jì)算就可求出SOD的酶活性。

三、固定化酶技術(shù)（一）固定化技術(shù)概述（二）酶和菌體固定化技術(shù)（三）固定化細(xì)胞的反應(yīng)器☆（一）固定化技術(shù)概述

概說：酶已廣泛應(yīng)用工業(yè)及家庭日常生活中。如1、淀粉酶都采用酸解法，現(xiàn)在很多都用酶解法。家庭所用甜酒藥就是根霉。我們知道還有2、蛋白酶（如醬油、豆腐乳等）；3、果膠酶（如酒類澄清、白蓮脫皮）；4、脂肪酶（如皮毛脫脂）等。隨著酶制劑的廣泛應(yīng)用，人們也注意到酶的一些不足之處，例如：（1）溶液中的游離酶只能一次性使用，不僅造成酶的浪費(fèi)，而且會(huì)增加產(chǎn)品分離的難度和費(fèi)用，影響產(chǎn)品的質(zhì)量。（2）溶液酶很不穩(wěn)定，在溫度、pH值和無機(jī)離子等外界因素的影響下，容易變性失活。以后人們想將酶固定化，能連續(xù)使用。從而生產(chǎn)了固定化酶。目前固定化酶在工業(yè)應(yīng)用還很少，原因是，手續(xù)繁，成本高。近年來，工業(yè)上應(yīng)用多采用固定化微生物法。將產(chǎn)酶的微生物直接固定在載體中，裝柱生產(chǎn)。固定化酶（immobilizedenzyme）的研究從50年代開始。1、1953年德國的格魯布霍費(fèi)（Grubhofer）和施來思（Schleifh）采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，經(jīng)重氮化法活化后，與淀粉酶結(jié)合，而制成固定化酶。

2、1969年日本的千畑一郎首次在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模應(yīng)用固定化氨基酸化酶，從DL—氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L—氨基酸。固定化酶的發(fā)展簡史3、1976年千畑一郎用聚丙烯酰胺凝膠包埋產(chǎn)氨短桿菌，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L—蘋果酸。4、1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸，取得進(jìn)展。（二）酶和菌體固定化技術(shù)

固定化酶、固定化菌體都是以酶的應(yīng)用為目的，它們制備和應(yīng)用方法也基本相同。但細(xì)胞的固定化主要適用于胞內(nèi)酶，要求底物和產(chǎn)物容易透過細(xì)胞膜。這里只介紹工業(yè)上應(yīng)用較廣的菌體細(xì)胞的固定化方法。①無需進(jìn)行酶的分離純化；②細(xì)胞保持酶的原始狀態(tài)，固定化過程中酶的回收率高；1976年法國首次用固定化酵母生產(chǎn)啤酒和酒精。目前我國L—蘋果酸的生產(chǎn)主要是固定化細(xì)胞法。固定化菌體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)在于（一）凝膠包埋法將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)稱為包埋法。見圖。是將細(xì)胞包埋在各種凝膠內(nèi)部的微孔中，制成一定形狀的固定化細(xì)胞，大多數(shù)為球狀，（表面積大、耐壓、使用半衰期長）或塊狀（某些凝膠難成球狀）。●包埋法瓊脂海藻酸鈉，卡拉膠（角叉菜膠），聚丙烯酰胺凝膠等。

常用的凝膠1．瓊脂

瓊脂是我們最熟悉的凝膠，2%的濃度可制成固體培養(yǎng)基。作為固定化細(xì)胞的載體，可根據(jù)包埋菌的大?。?xì)菌或酵母）選擇濃度合適的瓊脂，溶化后50℃水浴中保溫，加入菌體，充分?jǐn)嚢?，使之分散均勻。冷卻凝固后切成塊。缺點(diǎn)是機(jī)械強(qiáng)度較差。如增加瓊脂的濃度，則網(wǎng)格孔徑太小，通透性差。

2．海藻酸鈉海藻酸鈉是d－甘露糖醛酸和Ｌ－古羅糖醛酸通過１.４鍵聯(lián)接組成。它的優(yōu)點(diǎn)是在水相中海藻酸鈉呈溶解狀，具有一定粘度，將其滴入鈣溶液中，由于離子轉(zhuǎn)移的膠凝作用，便形成珠狀顆粒。

3．卡拉膠卡拉膠是一種含有許多硫酸根基團(tuán)的多糖化合物，也屬于天然凝膠。作為包埋載體同瓊脂一樣，加熱溶化，遇冷凝固。不同點(diǎn)在于，在鉀離子存在下，凝膠的機(jī)械強(qiáng)度大大增加?？ɡz的缺點(diǎn)是需要在45℃—55℃之間加入菌體，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，有時(shí)菌體還未攪拌均勻，便已凝膠，如溫度較高加入，酶的活性會(huì)受到影響。4．聚丙烯酰胺凝膠用聚丙烯酰胺凝膠制備的固定化細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度高，可通過改變丙烯酰胺的濃度以調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，適用于多種細(xì)胞固定化。缺點(diǎn)是丙烯酰胺單體對(duì)細(xì)胞有一定的毒害作用，應(yīng)盡量縮短聚合時(shí)間。

固定化細(xì)胞的特性與游離酶和天然細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞具有下列的性質(zhì)：1．酶活力的穩(wěn)定性增加各種固定化細(xì)胞具有一定的酶活力的半衰期，半衰期越長，說明固定化細(xì)胞酶活力的穩(wěn)定性越強(qiáng)。如大腸桿菌經(jīng)三醋酸纖維素包埋后，用于生產(chǎn)L—天門冬氨酸于37℃連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)兩年后，仍保持原活力的97%。2．酶促效率明顯提高和固定化酶不同，菌體細(xì)胞在固定化過程中通常不損傷細(xì)胞本身，細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)也最大限度地保持著天然狀態(tài)，因此它具有較高的酶促效率。3．熱穩(wěn)定性增強(qiáng)如惡臭假單孢菌經(jīng)包埋后最適反應(yīng)溫度較游離細(xì)胞提高20℃，而且熱穩(wěn)定性也增強(qiáng)。4．易產(chǎn)生副反應(yīng)微生物菌體細(xì)胞內(nèi)含有龐大而復(fù)雜的酶系統(tǒng)，其中一些酶在生產(chǎn)時(shí)是我們不需要的，某些酶甚至是有害的，它們可催化生產(chǎn)影響產(chǎn)品質(zhì)量的物質(zhì)。如包埋黃色短桿菌（產(chǎn)延胡索酸酶）生產(chǎn)L—蘋果酸時(shí)，便有副產(chǎn)物琥珀酸產(chǎn)生，它是影響產(chǎn)品出口的主要因素。生產(chǎn)上一般采用膽汁酸處理固定化細(xì)胞，可顯著降低琥珀酸的含量。

（三）固定化細(xì)胞的反應(yīng)器

反應(yīng)器的特點(diǎn)和類型反應(yīng)器的類型很多，其分類的方法主要有：按進(jìn)料和出料的方式可分為：①分批式，②連續(xù)式反應(yīng)器

（a）分批式攪拌罐反應(yīng)器；（b）連續(xù)式攪拌罐反應(yīng)器；（c）連續(xù)流動(dòng)攪拌罐一超濾膜反應(yīng)器；（d）填充式反應(yīng)器；（e）循環(huán)反應(yīng)器；（f）流化床反應(yīng)器。Flash1L—蘋果酸是一種重要的有機(jī)酸，在醫(yī)藥和食品工業(yè)中有廣泛用途。L—蘋果酸生產(chǎn)途徑有（1）用葡萄糖直接發(fā)酵：（2）用延胡索酸為原料酶法合成；目前國內(nèi)L—蘋果酸工業(yè)化生產(chǎn)主要是用延胡索酸為原料的酶法合成。普遍使用的包埋載體是卡拉膠（K—carrageenan）。

(四）L-蘋果酸生產(chǎn)①黃色短桿菌發(fā)酵離心收集菌體②卡拉膠制備混合、切塊③延胡素酸鈉裝柱蘋果酸鈉蘋果酸鈣蘋果酸

固定化細(xì)胞生產(chǎn)L—蘋果酸流程

（一）菌種培養(yǎng)1．菌種黃色短桿菌（Brevibacteriumflavum），購于中科院微生物所菌種保藏室。斜面和平板培養(yǎng)基為普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基。菌落呈金黃色，圓形，直徑1mm左右，表面光滑，濕潤。2．菌種篩選和保藏通過平板劃線法進(jìn)行優(yōu)良菌種的分離、篩選，再從平板上挑選單菌落接于試管。試管菌種于37℃培養(yǎng)24h，放置4℃冰箱保存，2~3個(gè)月轉(zhuǎn)接一次，也可用石蠟封存，放4℃冰箱可保存1年左右。3．一級(jí)搖瓶種培養(yǎng)基配方：檸檬酸氫二胺2.5%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.2%，玉米漿5%，pH7.0，500毫升三角瓶裝液100毫升，于121℃滅菌30min，。嚴(yán)格無菌操作，30℃，搖瓶轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)18~24小時(shí)。4．二級(jí)搖瓶種培養(yǎng)基和操作條件同上，每瓶一級(jí)搖瓶種接10瓶二級(jí)搖瓶種。放雙層工業(yè)往復(fù)