大黃、水蛭等對(duì)腎大部切除所致大鼠慢性腎衰保護(hù)作用的影響

大黃、水蛭等對(duì)腎大部切除所致大鼠慢性腎衰保護(hù)作用的影響

腎功能疾病的最終結(jié)果是腎小管硬化的形成。腎小球硬化是多種原因引起的腎小球損傷后出現(xiàn)的共同轉(zhuǎn)歸,是慢性腎功能衰竭(CRF)的主要病理基礎(chǔ)。近年來(lái),隨著對(duì)腎小球硬化機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷深入,各種細(xì)胞因子在腎功能進(jìn)行性減退過(guò)程中所引起的作用備受關(guān)注。因此,本研究目的旨在從細(xì)胞因子水平觀察大黃、水蛭等復(fù)方對(duì)腎大部切除大鼠腎臟保護(hù)的作用機(jī)制。1實(shí)驗(yàn)材料1.1藥物、試劑與儀器大黃RheumpalmatumL.10g、水蛭WhitmaniapigraWhitman15g、二丑PharbitisnilL.各20g,黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.50g,附子AconitumcarmichaeliDebx.10g,人參PanaxginsengC.A.Mey.15g,白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.15g,丹參SalviamiltiorrhizaBge.20g,王不留行Vaccariasegetalis(Neck.)Garcke15g組成,購(gòu)自哈爾濱寶豐藥店,其制劑由哈爾濱商業(yè)大學(xué)制藥工程學(xué)院制劑室提供。附子一味,粉或粗粉加2%HCl水溶液滲,至無(wú)生物堿反應(yīng),滲濾液濃縮,備用,其余藥物加水提取二次,每次1.5h,合并提取液,濃縮液與上述兩種提取液混合,并濃縮至浸膏狀,加乙醇使醇濃度達(dá)60%,靜置12h以上,濾過(guò),濾液回收乙醇并濃縮至稠膏狀(60℃熱測(cè),相對(duì)密度1.34～1.40),加入糖粉混合均勻,制成軟材,用顆粒機(jī)制成顆粒,干燥分裝即得。腎衰寧膠囊,云南理想藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號(hào):002875。包醛氧淀粉,天津太平洋藥業(yè)有限公司,批號(hào):002404。大鼠TNF-αELISA試劑盒,由深圳晶美生物工程有限公司提供。戊巴比妥鈉,購(gòu)自哈爾濱市化學(xué)試劑商店。肌酐,批號(hào):020801;尿素,批號(hào):020701;由北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn);苦味酸,黑龍江省臨床檢測(cè)中心提供。青霉素鈉80萬(wàn)單位,哈藥集團(tuán)制藥總廠。批號(hào):20010202。羧甲基纖維素鈉,上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)。批號(hào):020512。全自動(dòng)生化分析儀,型號(hào):7170,日本生產(chǎn)檢測(cè)尿蛋白。全自動(dòng)生化分析儀,型號(hào):LISA300plus,法國(guó)生產(chǎn)。離心機(jī),型號(hào):LXJ-Ⅱ,上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1腎大型手術(shù)組模型制作參見(jiàn)文獻(xiàn),并作部分改進(jìn),取雄性Wistar大鼠62只,體重150～200g,用2%戊巴比妥鈉40mg/kg,經(jīng)腹腔注射麻醉大鼠后,將其置于溫暖手術(shù)臺(tái),剪毛,經(jīng)腹部正中切開,暴露左側(cè)腎臟,結(jié)扎左上支和中支腎動(dòng)脈,同時(shí)切除左腎2/3,并摘除右腎。假手術(shù)組僅切開皮膚及肌肉層,不切除腎臟。手術(shù)后,各組均腹腔注射青霉素72萬(wàn)單位/kg,連續(xù)3d。腎大部切除術(shù)中,由于麻藥溫度環(huán)境出血及切除組織過(guò)大,造成大鼠死亡率較高,術(shù)后天微危險(xiǎn)期,第5d相對(duì)平穩(wěn),且術(shù)前分組易形成一組死亡過(guò)多,一組死亡過(guò)少,一組狀態(tài)好,一組狀態(tài)差,達(dá)不到隨即均衡的要求。因此,術(shù)后一周將大鼠隨機(jī)分成7組:(1)假手術(shù)組(7只),腎大部切除組(10只),包醛氧淀粉組(9只),腎衰寧組(7只),大黃、水蛭高劑量組(10只),中劑量組(9只),低劑量組(10只)。2.2各組大鼠、水蚤、小劑量給藥假手術(shù)組和腎大部分切除組每日給予等量自來(lái)水灌胃。包醛氧淀粉不溶于水,用3%羧甲基纖維素鈉(CMC)溶解藥物,按0.9g/kg給藥;腎衰寧組按0.37g/kg給藥;大黃、水蛭高劑量組按55.8g/kg給藥,中劑量組按27.9g/kg給藥,低劑量組按13.95g/kg給藥。四周后,將所有大鼠置于代謝籠中,收集24h尿液,然后將大鼠稱重,摘眼球取血,摘取殘腎稱腎重,10%甲醛固定,行HE染色,進(jìn)行組織學(xué)觀察。2.3檢測(cè)方法2.3.1“抗體-tnf-抗體”的制備方法采用雙抗體夾心ELISA法。抗大鼠TNF-α單抗包被于酶標(biāo)板上,加入標(biāo)本/標(biāo)準(zhǔn)品與之結(jié)合,再加入生物素化檢測(cè)抗體,兩抗體與標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本中的TNF-α形成“抗體-TNF-α抗體”復(fù)合物,游離的成分被洗去。再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素,生物素與親和素特異結(jié)合,未結(jié)合的部分被洗去。加入顯色劑,若反應(yīng)孔中有TNF-α,無(wú)色的顯色劑顯藍(lán)色,加終止液變黃。在450nm處測(cè)OD值,TNF-α濃度與OD450值之間呈正比,可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中TNF-α濃度。2.3.2血清scr測(cè)定采用苦味酸法,在堿性溶液中,苦味酸鹽與肌酐作用生成黃紅色的苦味酸肌酐復(fù)合物。2.3.3血清bun的測(cè)定采用紫外法,在340nm處測(cè)定NADH的吸光度,其下降速度與尿素濃度成正比。2.3.4色混合物的最大吸收采用終點(diǎn)法,連苯三酚與鉬酸結(jié)合形成紅色復(fù)合物,在467nm處有最大吸收。當(dāng)這個(gè)復(fù)合物在酸性條件下與蛋白結(jié)合成藍(lán)紫色復(fù)合物,在598nm有最大吸收。2.4統(tǒng)計(jì)分析計(jì)量數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,組間比較,用t檢驗(yàn),采用MATLAB統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。3結(jié)果3.1各組腎衰寧、各組監(jiān)測(cè)結(jié)果比較2.給藥后各組與腎大部切除組均有顯著差異(P<0.01)。高劑量組與正常組有差異(P<0.01),與腎大部切除組及包醛氧淀粉組比較有顯著性差異(P<0.01),與腎衰寧組比較有差異(P<0.01);中劑量組與腎大部切除組、包醛氧淀粉組、腎衰寧組比較均有顯著性差異(P<0.01),與正常組比較有差異(P<0.01);低劑量組與腎大部切除組、包醛氧淀粉組、腎衰寧組比較均有顯著性差異(P<0.01),與高劑量、中劑量組比較有差異(P<0.01);與正常組比較無(wú)差異,結(jié)果見(jiàn)表1。3.2高、中、低劑量組bun、scr的比較腎大部分切除組大鼠BUN、Scr明顯高于各組(P<0.01),高、中、低劑量組BUN、Scr均能降低,其作用優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組,結(jié)果見(jiàn)表2。3.3各組大鼠腎重比較給藥四周后,將所有大鼠置于代謝籠中,收集24h尿液,然后將大鼠處死摘取殘腎,稱腎重。腎大部切除組大鼠左腎重明顯重于其他各組大鼠腎重與高、中劑量組比較差異顯著(P<0.001),與包醛氧淀粉組、腎衰寧組、低劑量組比較有差異(P<0.05);給藥后各治療組均能降低24h尿蛋白的含量,與腎大部切除組比較差異顯著(P<0.001),大黃、水蛭等高、中、低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較效果顯著,見(jiàn)表3。4對(duì)腎、腎、tnf-的影響TNF-α是導(dǎo)致腎功能不全發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要炎癥介質(zhì)。研究表明,慢性腎功能不全非透析治療,持續(xù)腹膜透析和血液透析患者血漿TNF-α及其受體水平較正常對(duì)照組升高,可能為產(chǎn)生增多或排泄障礙所致。TNF-α隨腎功能的惡化逐漸升高。Witko等研究發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者與氧化應(yīng)激的新標(biāo)志物-終未氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)密切相關(guān),提示慢性腎功能不全(CRF)免疫功能紊亂由炎癥介質(zhì),氧化應(yīng)激等多種機(jī)制引起。本研究結(jié)果表明各組腎大部切除大鼠血中TNF-α均較假手術(shù)組高,說(shuō)明CRF時(shí)分泌亢進(jìn)。服用大黃、水蛭等的大鼠,血中TNF-α含量明顯低于腎大部切除組、包醛氧淀粉組、腎衰寧組,提示該方具有阻斷或減少TNF-α分泌的作用,由于其分泌的減少,從而抑制腎小球系膜細(xì)胞,系膜基質(zhì)增殖,減輕腎小球硬化的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn),服用大黃、水蛭后,各組大鼠腎重、尿蛋白及BUN、Scr減少,且差異有顯著性意義。而腎臟重量的增加我們考慮與腎小球內(nèi)系膜細(xì)胞增殖及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。該方能抑制這些細(xì)胞的增殖,無(wú)疑有助減輕腎臟的腫大。降低CRF大鼠血清BUN、Scr,能改善腎功能。本研究結(jié)果表明:各治療組間以低劑量組效果最好。我們考慮機(jī)體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生多種廢物,絕大部分產(chǎn)物由腎臟排出。腎大部分切除后,殘余腎單位出現(xiàn)進(jìn)行性的小球玻璃樣變和硬化。腎小球?yàn)V過(guò)率降低。殘余腎單位腎小管出現(xiàn)代謝亢進(jìn),導(dǎo)致耗氧量增加和氧自由基生成增加,Na+-H-反向轉(zhuǎn)運(yùn)亢進(jìn)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+流量增多,引起小管一間質(zhì)損害不斷加重和腎單位的進(jìn)一步喪失。中藥復(fù)方制劑經(jīng)過(guò)機(jī)體代謝后產(chǎn)生有機(jī)離子,這些物質(zhì)主要經(jīng)過(guò)腎臟被排泄,腎臟損害時(shí),腎小球?yàn)V過(guò)率降低,腎小管對(duì)有機(jī)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能降低甚至喪失,高濃度劑量藥物只能加重腎臟負(fù)擔(dān)不能完全被濾過(guò)、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝而發(fā)揮作用,因此低劑量藥物效果較好。尿蛋白在腎小管