腎纖康對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子

腎纖康對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子

腎纖維素質(zhì)是腎腸疾病發(fā)展到最終階段的共同病理基礎(chǔ)，主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)過度聚集。腎間質(zhì)纖維化程度與腎功能受損程度呈高度相關(guān)性,尋找抗腎間質(zhì)纖維化的藥物已成為預(yù)防和治療慢性腎衰竭的焦點(diǎn)。近年分子生物學(xué)研究認(rèn)為,細(xì)胞因子和細(xì)胞信號通路表達(dá)和傳導(dǎo)異常在引起腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制中有重要作用,而在多種細(xì)胞因子中,轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)在腎間質(zhì)纖維化的病理過程中貫穿始終。腎纖康是我院院內(nèi)制劑,應(yīng)用于臨床已6年,前期研究已表明該藥通過阻斷TGF-β1的生成減少腎間質(zhì)ColⅢ、FN的表達(dá),減少細(xì)胞外基質(zhì)的合成,從而達(dá)到抗腎間質(zhì)纖維化的作用。Smad2、Smad3、Smad7是TGF-β信號傳導(dǎo)通路中重要的下游轉(zhuǎn)錄因子,通過對受TGF-β調(diào)控的Smad信號通道的干預(yù)成為延緩和逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的新的可能靶點(diǎn)。材料和方法1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥物1.2測試試劑1.4實(shí)驗(yàn)動物2實(shí)驗(yàn)方法2.1模型生產(chǎn)2.4指標(biāo)檢測方法2.4.1排尿素氮和血肌酸鹽的測定2.4.2免疫組織化學(xué)染色2.4.3腎小管間質(zhì)病理改變2.4.4病理圖像分析3統(tǒng)計(jì)方法結(jié)果1造模成功與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與假手術(shù)組相比,各組BUN及Scr水平均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明造模成功。腎纖康組、苯那普利組相比,上述數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。2各組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)的變化肉眼觀察假手術(shù)組腎組織紅潤無腫大,模型組、腎纖康組、苯那普利組病側(cè)腎臟體積明顯增大,顏色變白,皮質(zhì)變薄。HE染色結(jié)果,假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)無明顯改變,排列、分布及形態(tài)均正常。模型組腎小管上皮細(xì)胞萎縮、變性、壞死、脫落,部分管腔囊性擴(kuò)張或萎縮,腎間質(zhì)增寬,單核、淋巴細(xì)胞浸潤和纖維組織形成。腎纖康組和苯那普利組病側(cè)腎臟病理改變與模型組相比均有不同程度減輕,間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞呈小灶性浸潤,少許上皮細(xì)胞腫脹,腎小管輕度擴(kuò)張。見圖1。3腎纖康對腎質(zhì)纖維化程度的影響由表2可知,假手術(shù)組無腎小管間質(zhì)損害。模型組、腎纖康組、苯那普利組均出現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化,腎纖康組、苯那普利組腎小管間質(zhì)纖維化程度較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩治療組纖維化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4兩組d7面積比對比由表3可知模型組、腎纖康組、苯那普利組腎間質(zhì)Smad2、Smad3、TGF-β1面積比增加,Smad7面積比減少,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,兩藥物治療組腎間質(zhì)Smad2、Smad3、TGF-β1表達(dá)減弱,面積比減少,Smad7表達(dá)增強(qiáng),面積比增加(P<0.05);腎纖康組與苯那普利組面積比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2～圖5。腎纖康、smad7對變異性的調(diào)控腎小管-間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同病理基礎(chǔ),許多炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與其發(fā)病過程。TGF-β1是目前認(rèn)為最重要的致纖維化生長因子,TGF-β1在腎間質(zhì)的表達(dá)越強(qiáng)則ECM合成越多,預(yù)示著腎間質(zhì)纖維化越嚴(yán)重。因此,阻斷或降低TGF-β1的表達(dá),有助于減慢腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。Smad信號蛋白是目前所知的唯一TGF-β1受體的胞內(nèi)激酶底物,是TGF-β家族下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,TGF-β介導(dǎo)的纖維化都涉及Smad信號通路。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能Smads蛋白分為R-Smads(receptor-activatedSmads)、Co-Smads(common-partnerSmads)、I-Smads(inhibitorySmads)三類。Smad2、3屬于R-Smads,他們都具有相對保守的C-末端和N-末端,可以通過C端的SSXS結(jié)構(gòu)域磷酸化而實(shí)現(xiàn)信號傳導(dǎo)。Smad7屬于I-Smads,是TGF-β信號傳導(dǎo)中重要的負(fù)性調(diào)控因子,它與活化的TGF-βⅠ型受體穩(wěn)定結(jié)合,阻止了R-Smads的磷酸化激活。Smad2、3表達(dá)上調(diào),可促進(jìn)纖維化的發(fā)展,Smad7的激活則使腎臟纖維化得到改善。本實(shí)驗(yàn)表明模型組TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)增加,并伴有明顯的腎小管間質(zhì)纖維化,Smad7的表達(dá)則減少,這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。藥物治療組TGF-β1、Smad2、Smad3表達(dá)也升高,但與模型組相比表達(dá)減少,Smad7表達(dá)增加,腎間質(zhì)纖維化程度較模型組有明顯減輕。兩藥物治療組間TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明腎纖康有著苯那普利同樣的抗腎間質(zhì)纖維化作用。傳統(tǒng)中醫(yī)無腎纖維化一詞,根據(jù)其臨床表現(xiàn),一般屬于“水腫”、“虛勞”、“癃閉”、“關(guān)格”范疇,病理機(jī)制為臟腑功能受損,正氣虛衰,濕、痰、瘀、毒留著體內(nèi),形成了腎內(nèi)“微積”。積是體內(nèi)積塊,具有有形而堅(jiān)著不移的特點(diǎn),慢性腎臟病進(jìn)展時(shí)表現(xiàn)出細(xì)胞外基質(zhì)積聚,腎小球囊黏連,血管袢閉塞,局灶節(jié)段性腎小球硬化、腎間質(zhì)纖維化均可歸屬于腎內(nèi)“微積”范疇,由此提出了補(bǔ)益脾腎、通絡(luò)消、解毒泄?jié)岬闹委煷蠓?組方為腎纖康。方中黃芪補(bǔ)脾腎之氣以扶正,水蛭活血消,大黃化痰行瘀,解毒瀉濁,當(dāng)歸、莪術(shù)補(bǔ)血活血。現(xiàn)代藥理研究也證實(shí)黃芪當(dāng)歸合劑能有效降低腎臟慢性纖維化過程中腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1表達(dá)量,抑制系膜細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化、轉(zhuǎn)型,進(jìn)而減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚;大黃酸在體外能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞肥大及細(xì)胞外基質(zhì)合成增加,水蛭素能抑制凝血酶所誘導(dǎo)的成纖維母細(xì)胞增殖和凝血酶對內(nèi)皮細(xì)胞的刺激損傷。本實(shí)驗(yàn)研究證明腎纖康通過抑制腎間質(zhì)促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá),使受其調(diào)控的Smad信號通道中Smad2、Smad3的表達(dá)減少,Smad7表達(dá)增加,從而延緩腎間質(zhì)纖維化,為臨床推廣該方應(yīng)用提供了理論依據(jù)。腎纖康由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院制劑室提供,1ml含生藥1.88g。腎纖康組成:黃芪、大黃、當(dāng)歸、莪術(shù)、水蛭等。苯那普利每片含量10mg,北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)。兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司、多克隆兔抗鼠Smad2、Smad3、Smad7試劑盒購自Cruz公司。1.3實(shí)驗(yàn)動物及分組CD-6多媒體圖像分析系統(tǒng)、OLYMPUSBX-50400倍光學(xué)顯微鏡。健康SD雌性大鼠40只,體重(180±20)g,瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將實(shí)驗(yàn)動物40只按體重分層隨機(jī)數(shù)字表分為對照組(假手術(shù)組)、模型組(手術(shù)組)、腎纖康治療組、苯那普利治療組,每組各10只。參照文獻(xiàn)介紹方法制作:在無菌條件下,將40只大鼠皮下注射鹽酸氯胺酮(150mg/kg)麻醉,于左側(cè)中腹部切開皮膚,游離左側(cè)輸尿管,除假手術(shù)組不結(jié)扎輸尿管縫合腹腔外,其余各組均分別在腎盂處和輸尿管上1/3處用絲線結(jié)扎后,切斷輸尿管,逐層縫合皮膚,即制備UUO模型2.2術(shù)后處理和隨訪假手術(shù)組和模型組用潔凈自來水每天灌胃1次,灌水量同各組用藥量。藥物組于術(shù)前1天,術(shù)后每日分別予腎纖康(12.5ml·kg-1·d-1,即23.55g·kg-1·d-1),苯那普利(10mg·kg-1·d-1)混懸液灌胃,術(shù)后2周末處死各組大鼠。每組隨機(jī)選8只大鼠取左側(cè)腎臟作各項(xiàng)指標(biāo)檢查。2.3免疫組織化學(xué)檢測指標(biāo)將各組大鼠水合氯醛腹腔注射麻醉,從頸總動脈采血,離心分離血清,檢測尿素氮、血肌酐。斷頸處死所有大鼠,取左腎上極腎組織作常規(guī)石蠟切片(片厚作染色免疫組化檢查尿素氮采用GLDH動力學(xué)法,血肌酐采用酶法,由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院檢驗(yàn)科測定SABC法(1)4μm厚的石蠟切片常規(guī)脫蠟水化;(2)浸入3%過氧化氫5min(去除內(nèi)源性過氧化氫酶活性);(3)1%正常羊血清封閉;(4)滴加稀釋的1抗(TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7多克隆抗體,稀釋度均為1∶100),4℃過夜,PBS沖洗3次;(5)滴加過量羊抗兔IgG,室溫1h,PBS沖洗3次;(6)滴加SABC復(fù)合物,室溫1h,PBS沖洗;(7)DAB顯色、蘇木紫復(fù)染、脫水、透明、封固。以PBS代替一抗作為陰性對照腎小管間質(zhì)損害程度參照國內(nèi)唐政分類,將其分為Ⅲ級,即Ⅰ級:小管間質(zhì)病變散在輕微,范圍<15%;Ⅱ級:病變呈灶性或小片性分布,范圍≥15%,<50%;Ⅲ級:病變呈片狀或彌漫分布,范圍≥50%。免疫組織化學(xué)染色后,