海洋細菌的生境與天然藥物篩選

海洋細菌的生境與天然藥物篩選

具有新結(jié)構(gòu)或新作用機制的天然化合物不僅是化學合成藥理學的重要依據(jù)，也是藥理學開發(fā)的主要內(nèi)容。豐富的海洋生物資源無疑是天然藥物篩選的重要來源。早期的海洋藥物研究主要集中在大型海藻和無脊椎動物代謝產(chǎn)物的分離上。但就多樣性和工業(yè)化規(guī)模操作的可行性而言,海洋微生物的潛力更大。然而,90%以上的臨床藥物由微生物產(chǎn)生與至今為止還沒有一種來自海洋微生物的天然藥物應(yīng)用于臨床的現(xiàn)實,反映了我們對海洋微生物資源的認識和開發(fā)的不足。如通過顯微鏡方法觀察到的細菌目前只有不足5%可以被培養(yǎng),這個事實極大地限制了我們分離培養(yǎng)我們感興趣的菌和新細菌類群的能力。有關(guān)海洋微生物藥物的研究也遠不充分。早期的海洋微生物生物活性物質(zhì)研究的重點是抗病原微生物藥物的篩選,隨著新篩選模型的發(fā)明和運用,有關(guān)研究已擴大到幾乎所有的藥物范疇。一些在常規(guī)培養(yǎng)條件下難以生長的海洋微生物類群也逐漸引起人們的重視,成為發(fā)掘新化合物的重要來源。本文就海洋微生物的生物活性代謝產(chǎn)物的研究進展結(jié)合海洋微生物的生境分布進行綜述。1海洋細菌群落的組成海洋細菌是所有海洋微生物中生物活性物質(zhì)研究報道最多的。革藍氏陰性細菌是海洋化能異養(yǎng)原核生物中最大、最多樣化的組群,在海水培養(yǎng)基上生長迅速,是可觀察到的細菌菌落的大多數(shù);而通常在各種物體表面生活、開放海水中不常見的、具有獨特形態(tài)發(fā)生特征的細菌則相對生長緩慢,在普通海水瓊脂平板上不易觀察到。但作為生物活性物質(zhì)產(chǎn)生菌,后者卻具有更為重要的意義。海洋細菌生境的差異不但影響存在的細菌類群,而且影響細菌代謝物的產(chǎn)生。根據(jù)分離菌樣品來源,我們可以將發(fā)現(xiàn)生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生菌分為海水細菌、沉積物細菌、深海細菌、共棲和共生細菌等。從已有的研究報道看,早期海洋微生物研究多取樣于海水,但有關(guān)代謝產(chǎn)物的報道很少;深海細菌產(chǎn)生生物活性代謝物的能力則由于方法學上的限制,未能完全反映其真實的情況,例如在3000米以下的深海淤泥中分離的AlteromonashaloplanktisSB-1123發(fā)現(xiàn)22員環(huán)含鐵體bisucaberin,但這是在常壓培養(yǎng)物中分離的。1.1sacnnal-co在沉積物細菌中最重要的微生物資源是海洋放線菌,如鏈霉菌屬主要發(fā)現(xiàn)在淺海區(qū)域,小孢囊菌屬和諾卡氏菌類群在深海中占優(yōu)勢。適應(yīng)了海洋環(huán)境的放線菌是工業(yè)微生物中一個重要的待開發(fā)資源,也是海洋微生物代謝產(chǎn)物中研究最多的,并且發(fā)現(xiàn)了許多獨有的特性。如從淺海淤泥中分離的StreptomycesgriseusSS-20能夠產(chǎn)生抑制瘧原蟲Plasmodiumberghei對小鼠的口服感染的AplasmomycinsA~C,但化合物僅在添加了含有日本生產(chǎn)的褐藻(Laminariasp.)產(chǎn)品“KobuCha”的培養(yǎng)基或與該菌生境相近的27℃和極低營養(yǎng)的培養(yǎng)基中合成。從Str.tenjimariensisSS-939的發(fā)酵液中分離的IstamycinsA和B,在結(jié)構(gòu)與陸地放線菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素鏈霉素和糖多孢菌素較為相近,但對氨基糖苷類耐藥的菌株有效。另有一種新的單萜生物堿altemicidin,是通過篩選對海蝦Artemiasalina的毒性作用而由Str.sioyaensisSA-1758培養(yǎng)物中分離。altemicidin對鼠白血病有效但毒性較大。此外,從海洋沉積物分離的鏈霉菌培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的新代謝物還包括anthranilamides、抑制人結(jié)腸癌細胞HCT-116的lagunapyronesA-C和廣譜抗菌的吩嗪的生物堿酯化物等等。在海洋放線菌中,鏈霉菌屬的研究明顯占有優(yōu)勢。但非鏈霉菌屬的放線菌也報道較多。如最早報道的海洋放線菌代謝物是ChainiapurpurgenaSS-228產(chǎn)生的benzanthraquinone,它能抑制小鼠艾氏瘤,低劑量使用可明顯延長病鼠壽命。該化合物也僅在含KobuCha的海水培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)。放線菌CNB-032的發(fā)酵產(chǎn)物maduralide是一種稀有的24員大環(huán)內(nèi)酯的新成員,這類內(nèi)酯以前僅報道過rectilavendomycin,生物學性質(zhì)尚不清楚。1.2發(fā)酵劑、生物酶和抗菌劑共棲海洋細菌寄居在其它生物表面、組織或內(nèi)腔,但與宿主之間的真正關(guān)系和相互作用了解不多。第一個鑒定的海洋細菌代謝物是從加勒比海草Thalassia表面分離菌Alteromonassp.產(chǎn)生的一種五溴吡咯化合物,表現(xiàn)強烈的抗革藍氏陽性菌活性(MIC=0.0063—0.2μg/ml)。由海藻表面生活菌FlavobacteriumugliginorinactanMP-55產(chǎn)生的,主要由葡萄糖、甘露糖和麥角藻糖組成的中性雜多糖marinactan能抑制小鼠肉瘤-180細胞的生長。共棲細菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)還包括被囊動物分離菌Pseudomonasfluorecens產(chǎn)生的andrimid和moiramidesA-C,嗜鹽農(nóng)桿菌產(chǎn)生的對耐藥革藍氏陽性細菌表現(xiàn)活性的thiotropocin,從一種蠕蟲的組織分離的Bacillussp.產(chǎn)生的,對一些耐短桿菌酪肽的菌株有效的新型環(huán)十肽抗生素loloatinB等。而含有噻唑啉和咪唑環(huán)的鄰苯二酚的含鐵體anguibactin則是從魚致病弧菌Vibrioanguillarum分離,該化合物的合成與一個65kb的質(zhì)粒相關(guān)。海洋放線菌是沉積物的主要居民已為共識,但它們在活體上的分布仍不清楚。而其分離菌的代謝物也具有重要的開發(fā)價值。如從柳珊瑚Pacifigorgiasp.表面分離的一株鏈霉菌能產(chǎn)生寡霉素-A的20-羥衍生物、腸菌素的5-脫氧衍生物,以及兩種全新的細菌毒化合物octalactinsA和B。Takahashi等從海魚Halichoeresbleekeri胃腸道分離的Str.Hygroscopicus菌株產(chǎn)生一組新型大環(huán)類化合物halichomycins,具有顯著的細菌毒活性。二環(huán)肽salinamidesA和B是由佛羅里達暗礁處的一種水母表面分離的鏈霉菌產(chǎn)生,其性質(zhì)和選擇抗性可能與萬古霉素相似。新近,又從軟珊瑚上生長的一株小孢囊菌屬新種的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)抗腫瘤的新縮肽物質(zhì)thiocoraline。1.3共生體體分離和活性化合物的活性成分海洋細菌可與海洋動植物形成高度相互依賴的共生關(guān)系,共生細菌產(chǎn)生毒素的首次證明來自neosurgatoxin的發(fā)現(xiàn),這是由日本食用的Babyloniajaponica消化腺直接分離的一種革藍氏陽性棒狀菌產(chǎn)生的,在其它地區(qū)的該動物已知是無毒的。Tetrodotoxin(TTX)已知名多年,在“fugu”(日本的一種美食),章魚,甚至陸地動物中均有發(fā)現(xiàn)。研究表明TTX可由至少15屬的淺海和深海單細胞細菌產(chǎn)生。在如此廣泛的細菌屬中發(fā)現(xiàn)同一種次級代謝產(chǎn)物說明毒素的產(chǎn)生體可能是一種可在海洋環(huán)境中能夠轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。Gil-Turnes等發(fā)現(xiàn)河口海蝦Palaemonmacrodactylus的卵有明顯的細菌附生物Alteromonassp.,當用抗生素處理除去附生物時,卵迅速地被致病真菌,尤其是Lagenidiumcallinectes感染。該共生菌的發(fā)酵導(dǎo)致一種意想不到的抗真菌化合物2,3-indolinedione(靛紅)的分離。作為生產(chǎn)染料靛藍的中間物,靛紅從未被用做抗真菌劑。Gil-Turnes還發(fā)現(xiàn),美國龍蝦Homarusamericanus的全身長滿了一種單細胞細菌,可產(chǎn)生大量的對羥苯基乙醇,似乎此簡單的酚能有效控制致病微生物發(fā)生。熱帶絲狀藍綠藻Microcoleuslyngbyaceus表面生活的四種極富色彩的共生菌株的發(fā)酵,可產(chǎn)生相同的具有明顯抗真菌和抗細菌活性的醌類化合物,這是首次報道天然產(chǎn)生的醌類化合物,可能是由泛醌型前體的氧化裂解形成。1996年Bewley等證明從海洋Theonellaswihnoei分離的兩種代謝物其實是由其共生菌產(chǎn)生。實際上,先前報道的許多海洋動植物的細胞毒等生物活性物質(zhì)是由其共生或共棲菌產(chǎn)生的。如Oclarit等1994年從海綿Hyatellasp.制備的勻漿中分離得到一株Vibriosp.,其發(fā)酵產(chǎn)物肽類抗生素andrimid也曾在該海綿的抽提物中發(fā)現(xiàn)。Diketopiperazines先前是作為海綿Tedaniaignis代謝物報道的,而從該海綿體中分離的一株亮桔色微球菌也可發(fā)酵產(chǎn)生。2其他抗生素海洋微藻是一大類光合微生物,在海洋環(huán)境中廣泛分布,并形成海洋食物鏈的基礎(chǔ)。盡管它們的代謝物在總體上并未真正了解,但某些微藻類群已知是化學物質(zhì)多產(chǎn)的,尤其甲藻是溫帶和熱帶海域的“赤潮”和其它魚類毒素的制造者。最近的研究表明某些甲藻能形成不尋常結(jié)構(gòu)類型的多醚類抗生素。微藻中的許多種都報道能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)。如1996年,Orjala和Gerwick從海洋藍綠藻Lyngbyamajuscula的脂提物中分離獲得一個新型脂肽barbamide,它對軟體動物Biomphalariaglabrata表現(xiàn)毒性。Phaeocystispouchetii產(chǎn)生的對細菌具有廣泛毒性的丙烯酸,產(chǎn)量可占藻體干重的7%,并通過海洋食物鏈轉(zhuǎn)移。其它報道的毒素還有由冷水海洋生境分離的Protogonyaulax屬的海洋甲藻產(chǎn)生的、與saxitoxin結(jié)構(gòu)相近的gonyautoxins等。3海洋真菌代謝資源真菌是海洋環(huán)境中的嚴重致病菌。如一些高等真菌可致海草如褐藻Sargassum的可見瘤,海綿廢棄病(sponge-wastingdisease)等,是水產(chǎn)養(yǎng)殖的一大問題;低等真菌也可對許多種的海洋無脊椎動物,海草,藻類致病。海洋真菌最常見的是沉木表面的木棲類群。化學防御是對有限資源競爭的重要適應(yīng)。為估測在此生境中種間競爭的程度,Strongman等(1987)比較了27種木棲真菌的抗真菌活性,發(fā)現(xiàn)四株Leptosphaeriaoraemaris菌產(chǎn)生倍半類萜的二羧基化合物culmorin,這也是某些陸地真菌產(chǎn)生的代謝物。真菌是海洋中常見的微生物,盡管陸地真菌是生物藥物的主要資源之一,但海洋真菌并未作為代謝物資源而被廣泛研究,藥物開發(fā)的潛力較小。海洋真菌生物活性物質(zhì)的報道較多的來自子囊菌,首次報道是在Leptosphaeriaoraemiaris中發(fā)現(xiàn)小內(nèi)酯化合物leptosphaerin。七十年代后期從一株海洋曲霉菌中分離了常見的細菌毒素膠霉毒素。從鹽沼草表面的耐鹽子囊菌Leptosphaeriaobiones中分離到一種新物質(zhì)obioninA,對中央神經(jīng)系統(tǒng)有抑制活性。對海洋真菌代謝物的深入研究是由意大利Trento小組報道的,海洋菌株Dendryphiellasalina的發(fā)酵導(dǎo)致主要代謝物dendryphiellinA的產(chǎn)生,進一步的分析發(fā)現(xiàn)了一系列相關(guān)化合物dendryphiellinB-D,最終分離得到酯dendryphiellinE,并闡明了這些代謝物合成過程。1998年Albaugh等報道在我國深圳近海沉積的紅樹木上分離獲得一株海洋真菌HypoxylonoceanicumLL-15G256,在其代謝物中發(fā)現(xiàn)一種新的作用于真菌細菌壁合成新靶位的脂肽類抗真菌物質(zhì)15G256γ,在溫室實驗中抑制真菌類植物病害的發(fā)生,并能抑制人的真菌病菌。4海洋微生物資源的開發(fā)亟需加強海洋生物學研究總的來說,醫(yī)藥工業(yè)新藥篩選的主要資源集中在某些微生物類群,如放線菌。這些工作在歷史上獲得了巨大成功,目前已有超過100種的藥物和動物治療產(chǎn)品由微生物發(fā)酵生產(chǎn)。這些成功促使大量的資金和人力用于從傳統(tǒng)的陸地資源尋找新藥。然而,從這些傳統(tǒng)資源的回報卻極大地降低,開發(fā)新的藥物產(chǎn)生菌變得迫切。海洋微生物是一個巨大的尚待開發(fā)的資源。在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的、極其多樣性的微生物為新藥開發(fā)提供了巨大的可能性。據(jù)估計,目前海洋微生物代謝產(chǎn)物被篩選的僅約為1%。對海洋微生物特殊營養(yǎng)要求等的深入了解,是有效地大規(guī)模開發(fā)海洋微生物資源所必需解決的前提。一般來說,影響“特殊”微生物生長代謝的因素主要是特殊的營養(yǎng)因子和培養(yǎng)條件。目前我們對大多數(shù)的海洋微生物知之甚少。一般的培養(yǎng)基組成,如蛋白胨,簡單的糖等并非理想的海洋營養(yǎng)素。在海洋環(huán)境中,復(fù)雜碳氮源如幾丁質(zhì),雜多糖、海洋蛋白質(zhì)等可能是海洋微生物的天然底物,并且還應(yīng)考慮小環(huán)境的特殊性。此外,對于無機元素如鋁,硅等(海洋沉積物中的大量元素)的影響也有待了解。海洋特定生境中的微生物常常對培養(yǎng)條件,如異常的溫度、壓力等有特殊的要求,目前我們在技術(shù)上還難以滿足。這些均限制了我們的工作和思路。分子生物學技術(shù)的應(yīng)用將從另一個角度為我們打開海洋微生物的大門。現(xiàn)階段海洋微生物的研究開發(fā)仍限制在那些“標準”條件下容易生長的少數(shù)微生物類群上。如前述的深海細菌的代謝物也是在我們所熟悉的“標準”條件下培養(yǎng)獲得的。此外,許多的研究都集中在海洋中易于培養(yǎng)的革藍氏陰性細菌,而對革藍氏陽性細菌除放線菌外幾乎未能引起重視。其實,革藍氏陽性細菌也是重要的藥物