生態(tài)環(huán)境微生物多樣性的研究進展

生態(tài)環(huán)境微生物多樣性的研究進展

在最近出版的《微生物工程》的第一章中，作者討論了微生物多樣性和微生物資源的開發(fā)，這表明人們需要找到進一步類型的微生物。眾所周知,現(xiàn)在人們所培養(yǎng)的微生物僅為自然界存在微生物中的少數(shù),約有1.0%,或更少,究其原因是在自然界存在的微生物不能在常規(guī)的分離平板上生長,它們是活的,但是尚未培養(yǎng)的微生物。另一方面,生態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)家采用分子DNA技術(shù),確認(rèn)在海洋、土壤等環(huán)境中存在著大量前所未知的微生物類型。Olsen等在1986年發(fā)表應(yīng)用這一技術(shù)探索自然環(huán)境中微生物多樣性的論文后,引起人們在這領(lǐng)域的重視。在過去的20年里,通過核酸技術(shù)人們在對微生物多樣性的深度和廣度的認(rèn)識取得空前的進展,例如在1987年已知可培養(yǎng)的微生物有26個類群(phyla),20年后的今天微生物類群已多達52個類群,其中半數(shù)是未經(jīng)培養(yǎng)的,而是經(jīng)核酸技術(shù)獲得的。這就擴大了人們對微生物世界多樣性的視野。當(dāng)然,盡管已取得上述這些進展,并不說明分離培養(yǎng)微生物工作已不再重要。因為利用核酸技術(shù)鑒定的類群為數(shù)巨大,對這些類群只知其存在,但對它們的形態(tài)、生理特性、代謝功能、對環(huán)境的影響等等,是難以進行實驗研究的,更談不到獲取有用的代謝產(chǎn)物,發(fā)展生物技術(shù)了。所幸,還有不少學(xué)者致力于新的分離培養(yǎng)技術(shù)的探索,突破傳統(tǒng)的概念,建立新的方法,獲得過去未曾想過的新類型,例如利用有毒的電子傳遞物質(zhì)的類群,微小的納米級的細菌等。本文扼要介紹這些新的類型微生物的獲得。1新生理型physios微生物的發(fā)現(xiàn)由于不同電子供體和受體成功地應(yīng)用,近年不斷發(fā)現(xiàn)前所未知的生理型微生物,如表1所示,采用非傳統(tǒng)的生長底物可以促進新型微生物的生長。1.1亞磷酸氧基亞硫酸鹽生物復(fù)合菌株d.phosph長期生長法磷幾乎全部以Ⅴ價的磷酸存在于自然界。最近Schink等于厭氧條件下,從海底沉積物中分離出氧化亞磷酸,同時還原硫酸鹽的無機化能自養(yǎng)細菌,在無機培養(yǎng)連續(xù)傳代2～4月的純培養(yǎng),經(jīng)分類研究,認(rèn)為屬產(chǎn)脫硫菌(Desulfatogenum)新種,定名為亞磷酸氧化產(chǎn)脫硫菌(D.phosphitoxidanssp.nov.)。該菌能在硫酸和亞磷酸存在下,以CO2為唯一碳源生長,倍增期為3～4天。除亞磷酸外,尚能氧化乙酸、氫、甲酸、富馬酸、葡萄糖等。菌體形態(tài)為具尖端的直桿菌,(0.6～0.8)×(2～4)μm,具運動功能,革蘭氏陽性。其在自然界的生態(tài)功能尚不明確,作者推測,遠在無氧存在時期地球上存在還原性磷,其在厭氧條件下還原硫酸可能是進化過程的殘留反應(yīng)。1.2亞砷酸和他亞甲基-265-二磷酸與上述亞磷酸氧化的化能自養(yǎng)菌相似的是氧化亞砷酸的化能自養(yǎng)菌(NT-26)的分離。Santini等從澳大利亞金礦中分出,革蘭氏陰性,具雙鞭毛桿菌,在無機培養(yǎng)基中,以亞砷酸為電子供體,氧為受體,以CO2為唯一碳源生長。16SrDNA序列分析表明NT-26屬于α-變形桿菌的土壤桿菌一根瘤菌分支,可能是一新種。另外,Oremland等從湖水中分離出兼性亞砷酸化能自養(yǎng)菌(MLHE-1)。細胞可在黑暗中固定14CO2,經(jīng)PCR試驗證明核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶的存在。除化能自養(yǎng)生活外,該菌尚能利用乙酸在有氧和硝酸鹽存在下無氧生活。16SrDNA序列分析,表明MLHE-1屬于α-變形桿菌的外硫紅螺菌屬(Ectothiorhodospira)。1.3脫鹵粘菌的檢測Sanford等采用2-氯苯酚富集方法從土樣和沉積物中分離到5株能于厭氧條件下,利用這類物質(zhì)的菌種,屬革蘭氏陰性桿菌,產(chǎn)生紅色素,具滑行運動,有孢子結(jié)構(gòu),能在2,5-二氯苯酚,2-溴苯酚等為電子受體,乙酸為電子供體,厭氧條件下生長。其16SrDNA序列與其他粘菌序列有9.0%的差別,作者認(rèn)為應(yīng)列為新屬,脫鹵厭氧粘菌(Anaeromyxobacterdehalogenansgen.nov.,sp.nov.)。類似的情況是在污染過氯酸環(huán)境,如火箭推進劑和炸藥生產(chǎn)廠附近土壤中,Achenbach等分離到能分解過氯酸的菌種,并分別定名為活力脫氯單胞菌(Dechloromonasagitata)和豬脫氯體(Dechlorosomasuillum)。1.4脫氯單胞菌的分離苯是石油來源燃料的主要組份,也應(yīng)用于多種化工制造業(yè),從而構(gòu)成地下水和地表水的污染。在厭氧條件下,其生物降解極為緩慢,迄今尚未分離出能在厭氧條件下降解苯的微生物。最近,Coates等分離出在這一條件下,以硝酸鹽為電子受體能完全氧化,單環(huán)芳香化合物的細菌,定名為脫氯單胞菌(Dechloromonas,strainsRCB和JJ),兩株菌均為革蘭氏陰性桿菌,兼性厭氧。系統(tǒng)分類上兩株菌十分相近,16SrDNA序列相似性達98.1%。1.5hs氧化hs的研究腐殖質(zhì)物質(zhì)(humicsubstances,HS)普遍存在于土壤、海洋和淡水域的沉積物中,前人認(rèn)為HS在厭氧環(huán)境是不易分解的有機物。近年的研究證明HS對厭氧呼吸和發(fā)酵細菌起著電子槽(electronsinks)的重要作用,就是在微生物細胞和不溶解性電子受體,如Fe(Ⅲ)氧化物之間充當(dāng)可溶性電子載體,并重新氧化,進行循環(huán)反應(yīng),促進有機物降解。Coates等借用HS的結(jié)構(gòu)相似物質(zhì),2,6-蒽氫醌二磺酸(AHDS)作為電子供體,硝酸鹽為電子受體,分離獲得6株能在厭氧下氧化AHDS的新細菌,分別屬于α,β,γ和δ變形桿菌。這一工作證明HS的微生物氧化是環(huán)境中普遍存在的反應(yīng)。1.6生化指標(biāo)hs有關(guān)Fe(Ⅱ)的化能自養(yǎng)細菌早有報道,如赭色纖發(fā)菌(Leptothrixochracea),加氏鐵柄細菌(Gallionellasp.)等。但這方面的深入研究面臨的困難是好氧菌從下列反應(yīng)Fe(Ⅱ)+0.25O2+H+→Fe(Ⅲ)+0.5H2O所獲得的可供利用的能量很低(△G～29KT/mol的鐵),以致化能自養(yǎng)鐵細菌的倍增期需幾個小時。另外,在中性pH條件,Fe(Ⅱ)的半衰期不過幾分鐘,要準(zhǔn)確測定Fe(Ⅱ)的生物氧化,必須排除非生物氧化的干擾。Emerson和Moyer在夏威夷群島附近深海低溫噴泉觀察到泉水中富含CO2和Fe(Ⅱ),但H2S卻極少,噴泉口四周由膠態(tài)細菌墊層和銹色氧化鐵所包圍,細菌濃度高達(1.9×107)～(5.3×108)/mL膠態(tài)物。作者在無機培養(yǎng)基,用稀釋法獲得純種培養(yǎng),并觀察到在純種培養(yǎng)中產(chǎn)生的絲狀氧化鐵噴泉口堆積者相似,指明海底氧化鐵沉積是由細菌的氧化作用產(chǎn)生。Neubauer等在濕地植物根際分離到化能自養(yǎng)鐵氧化細菌(BrT株),菌種只能在Fe(Ⅱ)存在下才能生長,在反應(yīng)器培養(yǎng)倍增期為25h。對活細胞與疊氮化鈉致死細胞進行比較,結(jié)果指出BrT氧化活力占總鐵氧化量的18%～53%,平均細胞得率約為0.70g/molFe(Ⅱ)氧化。上述工作,澄清了Fe(Ⅱ)氧化細菌的生化反應(yīng)和它的生物地質(zhì)功能。2各種生態(tài)區(qū)域的微生物多樣性的擴展2.1sar11的生物組成及序列Giovannoni等對廣泛存在于美國西海岸Sargasso海域及其他海洋的浮游細菌(SAR11)進行了細致的研究。首先,從美國Oregon州沿海的海水采樣,以補充磷酸鹽、銨鹽和有機碳源的海水為培養(yǎng)基,養(yǎng)料濃度比常規(guī)實驗室所用低三個數(shù)量級。在微孔平板上培養(yǎng)較長時間(23d),獲得的11個分離物,經(jīng)16SrRNA和16S～23SrDNA基因區(qū)間序列分析,找出系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,明確SAR11是屬于α-變形桿菌的一個分支。SAR11菌體較小,呈半月形,長0.37～0.89μm,直徑0.12～0.2μm,體積0.01μm3?；蚪M為1.54Mb。作者比較了美國太平洋沿岸和北大西洋52個水樣中細菌rRNA基因,結(jié)果表明SAR11是最豐富的類群,占有些地域表層總微生物群體的50%,亞透光區(qū)(subeuphotic)微生物群體的25%,經(jīng)過推算,全球海洋中SAR11細胞數(shù)目為2.4×1028,其中半數(shù)定居于亞透光區(qū)。顯然,這一類群是地球上最興旺的生物。2.2srrna基因序列及測序眾所周知,土壤有豐富的微生物,水稻田土壤又是影響全球氣候變暖的甲烷產(chǎn)生地,所以土壤微生物多樣性受到注意。Chin等對水稻田中主要的厭氧降解纖維素、木聚糖、果膠等物質(zhì)的微生物進行分離,所用培養(yǎng)基為Difco營養(yǎng)湯,濃度是常規(guī)的1/100,結(jié)果表明水稻田土樣所含細菌細胞總數(shù)測定每克干樣為2.4×108。采用逐步稀釋法獲得能培養(yǎng)的9個分離株,約占總計數(shù)的5%,分屬于6個群:Verrucomicrobia,Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroids,梭菌簇XLVa。9株分離株的16SrRNA基因序列均不同于已知序列。Jansson等對澳大利亞草原土樣經(jīng)超聲勻漿、離心處理提高了活菌計數(shù),采用常規(guī)營養(yǎng)液1/100濃度的培養(yǎng)基,獲得30個分離株,其16SrRNA基因序列大都屬于新的譜系,如Actinobacteria,Acidobacteria,Proteobacteria,和Verrucomicrobia.2.3zas-2的生長與代謝產(chǎn)物昆蟲消化道是微生物的重要生境,特別是螺旋體。Leadbetter等從白蟻消化道取樣,在H2和CO2氣相下培養(yǎng),獲得2株螺旋體純培養(yǎng)(ZAS-1,ZAS-2),形態(tài)與大小都相似[0.2μm×(3～7)μm],其16SrRNA序列相似程度高達98%。ZAS-2生長需要H2,用14CO2標(biāo)記物證明其代謝產(chǎn)物為甲酸與乙酸,如下式所示:4H2+2CO2→CH3CO2H+2H2O,H2+CO2→HCO2H乙酸為主產(chǎn)物(80%)。與ZAS-2不同,ZAS-1可以在N2下生長,同時產(chǎn)生甲酸和乙酸,甲酸多于乙酸。螺旋菌在白蟻消化道產(chǎn)生的揮發(fā)酸為宿主提供了碳源和能源。同一群學(xué)者又進一步證明白蟻后消化道和淡水域沉積物中的螺旋體具有同源固氮基因(nifH)和固氮活力。這一活力的確證,使我們認(rèn)識到螺旋體對白蟻生活的重要性。白蟻所食用的木材含氮極低(0.05%),如無螺旋體固氮的補充,昆蟲就難以正常生活。2.4球細胞內(nèi)微菌群的結(jié)構(gòu)上述從廣大海域分離到的SAR11類群就其形態(tài)大小,屬微小型細胞,其基因組與彎曲桿菌、支原體等相近。但更為微小的細菌是最近Huber等所報道的超高溫古細菌納米細菌。作者從冰島深海熱泉口取樣,于90℃在S、H2和CO2存在下,分離出超高溫的自養(yǎng)古細菌,——火焰球菌(Ignicoccus),并發(fā)現(xiàn)火焰球菌表面附有極小球形細胞,平均每個大球上有兩個小球。小球細菌可與大球細胞分離,但單獨培養(yǎng)不能生長,兩者共同培養(yǎng)則取得成功。作者研究了小球菌rRNA序列,證明ssrRNA基因與火球菌不同,也與已知的古細菌不同,屬于一個新的古細菌群。根據(jù)細胞形態(tài)微小程度屬納米范圍,并附生于火球菌細胞,故定名為騎火球納米古細胞(Nanoarchaeumequitans)。納米古細菌生理性狀知之甚少。細胞不能在火球菌細胞勻漿生長,必須與火球菌細胞接觸,才能生長。兩者共同培養(yǎng)于30L發(fā)酵罐(70～90℃),提高通氣(H2∶CO2),可使納米古細菌細胞濃度提高10倍,而火球菌并無變化。在發(fā)酵后期,80%的納米古細菌即行脫落,經(jīng)高速離心,可得1.5g濕細胞。其基因大小,經(jīng)測定為500kb,是已知原核細胞中最小者。鑒于其高溫厭氧生活與微小的基因組,納米古細菌可能是微生物生命比較更原始的形式,對其基因組和后基因組的深入探求,可為生命起源與進化提供有價值的資料。3新興的分離與培養(yǎng)方法新的分離培養(yǎng)方法的精髓是放棄傳統(tǒng)的平板技術(shù)所采用的人工合成、高濃度養(yǎng)料的培養(yǎng)基等。這里,扼要介紹細胞微膠囊與擴散小室兩種新方法。3.1微生物培養(yǎng)機制海水或土壤樣品的微生物都須加以濃縮,逐步稀釋,再與瓊質(zhì)(海水)混合,并制成多數(shù)微滴膠囊(microdroplets,GMDS),其中含有單個細胞的微膠囊,裝入滅菌層析柱,柱的入口和出口兩端都裝有過濾膜(圖1),入口膜(0.1μm)防止游離活細胞進入,出口膜(8μm)阻止柱內(nèi)繁殖的游離細胞逃逸。培養(yǎng)海洋樣品微生物樣品時層析柱灌注的培養(yǎng)基為滅菌海水、補充少量K2HPO4、NH4Cl、微量金屬與維生素。土壤樣品則用土壤抽出液用0.85%的NaCl液適當(dāng)稀釋。上述微膠囊中的細胞都是在同一開放式供應(yīng)的培養(yǎng)液中生長,在很大程度上模擬了自然環(huán)境。圖1的第二階段(phaseⅡ)是將第一階段(phaseⅠ)獲得的微菌落接種到豐富的有機培養(yǎng)基,微膠囊中的細胞群可長出膠囊,經(jīng)1周培養(yǎng),多數(shù)微孔菌濃度可達107/mL,并從中獲得有抑制真菌活力的培養(yǎng)。以上結(jié)果表明微膠囊技術(shù)具有高通量,并可為生理學(xué)、代謝產(chǎn)物以及細胞-細胞相互作用提供足夠的細胞量。3.2不同培養(yǎng)條件分離Kaberlein等作者設(shè)計擴散小室,用于海洋微生物的分離培養(yǎng)。海洋沉積物富含好氧異養(yǎng)微生物,濃度可達每克沉積物含109細胞,其中絕大部分是未經(jīng)培養(yǎng)的。沉積物的微生物經(jīng)過濃縮,適當(dāng)稀釋,接種于海水制成瓊脂,注入墊圈,并加蓋上膜。多個裝置的墊圈可放入養(yǎng)魚罐中,培養(yǎng)1周后,即有微菌落產(chǎn)生,其數(shù)可高達接種細胞的40%,微菌落中多數(shù)為混合培養(yǎng),須再次分離,以獲得純種。作者指出,此法的特色是模擬自然環(huán)境,使不同細胞經(jīng)過互喂,形成菌落。4營養(yǎng)方面的利用從上文所述,可以看出過去認(rèn)為不能培養(yǎng)的微生