骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎小管周血管瘤叢修復(fù)作用的研究

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎小管周血管瘤叢修復(fù)作用的研究

馬刀峰常用于中醫(yī)學(xué)。它具有關(guān)節(jié)木通、常用于身體、馬刀峰、青石、天仙藤、找骨風(fēng)等功效。具有利尿、抗感染、消炎、抗癌等功效。廣泛用于尿檢、關(guān)節(jié)疼痛、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和女性科炎癥。馬兜鈴酸腎病(aristolochicacidnephropathy,AAN)均是由于服用含AA的植物誘導(dǎo)產(chǎn)生的。慢性馬兜鈴酸腎病(chronicaristolochicacidnephropathy,CAAN)是AAN中最嚴(yán)重、預(yù)后最差的一種分型。腎臟病理可見腎小管周毛細(xì)血管叢(peritubularcapillary,PTC)減少,內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcell,ECs)凋亡、脫落,血管壁玻璃樣變,血管腔狹窄。PTC是維持著腎小管正常結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ),PTC密度下降與腎功能下降密切相關(guān)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)移植,近年來已成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。MSCs不僅支持造血系統(tǒng),理論上還可向中胚層和外胚層來源的組織分化。最近國(guó)內(nèi)外體內(nèi)、體外研究均已證明MSCs可向ECs分化,因此為應(yīng)用MSCs修復(fù)PTC,改善腎間質(zhì)-小管低氧狀態(tài),提供了契機(jī)。材料和方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及受體Wistar大鼠35只,健康清潔級(jí),動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2002-0009,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。供體:雄性Wistar大鼠5只,鼠齡5周,體重(160±5)g。受體:雌性Wistar大鼠30只,體重(200±5)g,鼠齡7周;其中20只經(jīng)關(guān)木通水煎劑灌胃12周制作慢性馬兜鈴酸腎病(CAAN)大鼠模型。2方法2.1pul-dmem培養(yǎng)液Wistar大鼠吸入性麻醉,取出雙側(cè)股骨,PBS液中沖洗,剔除表面附著的肌肉韌帶;用5mL注射器抽取L-DMEM培養(yǎng)液,自股骨近端向遠(yuǎn)端沖洗骨髓腔,重復(fù)數(shù)次,直至股骨呈白色。收集骨髓沖洗液,1000r/min,離心5min,棄除上清,PBS重懸細(xì)胞,重復(fù)2次。PBS調(diào)節(jié)5×106個(gè)細(xì)胞/mL密度的單細(xì)胞懸液后,小心地疊加到Percoll分離液的工作液上,2000r/min,離心20min;取白色霧狀的單核細(xì)胞層,加入2倍量的PBS后1000r/min,離心5min,棄除上清;用10%(體積分?jǐn)?shù))FBS的L-DMEM培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液后以1×105個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于塑料培養(yǎng)瓶中;置于37℃,5%CO2飽和濃度的CO2孵箱中培養(yǎng),3天后換液;貼壁細(xì)胞達(dá)到90%左右的融合后,以0.25%的胰蛋白酶在37℃水浴箱內(nèi)消化5min,以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。2.2熒光顯微鏡觀察第5代骨髓源細(xì)胞常規(guī)細(xì)胞爬片、固定,0.1%TritonX-100滲透10min,PBS沖洗,阻斷劑孵育30min;PBS沖洗后滴加封閉血清,30min;滴加一抗(兔抗鼠CD29多克隆抗體、兔抗鼠CD105多克隆抗體、兔抗鼠CD44多克隆抗體)37℃1h,PBS沖洗;滴加FITC或CY3標(biāo)記二抗,常溫避光反應(yīng)30min,PBS沖洗、甘油封片,熒光顯微鏡下觀察。另將第5代骨髓源細(xì)胞調(diào)整為1×106cell/mL的單細(xì)胞懸液,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD29、CD105、CD44表達(dá)情況,以鑒定第5代骨髓源細(xì)胞為MSCs。2.3組mscs的表達(dá)情況20只CAAN模型大鼠隨機(jī)分為兩組。MSCs移植組:10只,經(jīng)尾靜脈輸入1mL2×107cell/mL的MSCs;非移植組:10只,經(jīng)尾靜脈輸入1mL生理鹽水(NS)。正常對(duì)照組:正常雌性大鼠10只,予飲用水灌胃10mL/(kg·d),每天2次,連續(xù)灌胃12周后,經(jīng)尾靜脈輸入1mLNS。于MSCs及NS輸入后4周,分別處死大鼠,取腎組織標(biāo)本。2.4y染色和cd34表達(dá)2.4.1y染色采用熒光原位雜交(SRYFISH)及DAPI復(fù)染技術(shù),按照大鼠SRY-FISH試劑盒說明書操作同時(shí)參考文獻(xiàn)2.4.2mscs處理兔抗兔抗體檢測(cè)采用免疫熒光染色。(1)腎臟組織連續(xù)切片、烤片、脫蠟復(fù)水;(2)抗原修復(fù)后,3%H2O2室溫避光下孵育20min,PBS漂洗3次;(3)滴加正常山羊血清封閉液,室溫封閉30min左右,甩去多余液體,不洗;(4)滴加一抗(兔抗大鼠CD34多克隆抗體,工作液濃度1∶100),置于濕盒中,4℃過夜。(5)滴加二抗(CY3標(biāo)記的羊抗兔抗體,工作液濃度1∶150),37℃濕盒孵育30min,PBS洗3次,甘油封片。MSCs移植組和正常對(duì)照組腎組織切片按以上步驟處理后,在熒光顯微鏡下,FAM激發(fā)波長(zhǎng)λ=490nm,觀察采集位于細(xì)胞核內(nèi)的黃綠色熒光亮點(diǎn)圖像。DAPI激發(fā)波長(zhǎng)λ=340nm,觀察采集藍(lán)色熒光的細(xì)胞核圖像。CY3激發(fā)波長(zhǎng)λ=552nm,觀察采集位于細(xì)胞漿的紅色熒光。2.5免疫組化染色一抗:兔抗大鼠CD34單克隆抗體,工作液濃度1∶100多克隆抗體,工作液濃度1∶450;兔抗大鼠低氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxiainduciblefactor1α,HIF-1α)多克隆抗體,工作液濃度1∶150;二抗:羊抗兔抗體。按ABC法進(jìn)行免疫組化染色,DAB顯色;PBS替代一抗作為陰性對(duì)照;各組腎組織切片按上述步驟染色。腎組織切片每張隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野(×400),每個(gè)視野代表0.13mm2的區(qū)域面積。然后應(yīng)用顯微圖像分析系統(tǒng),對(duì)每個(gè)視野進(jìn)行分析,計(jì)算HIF-1α積分光密度值(IntegratedOpticalDensity,IOD),取平均值。CD34計(jì)算方法同HIF-1α。2.6son染色各組腎臟組織經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋作常規(guī)HE、Masson染色。Masson染色后,每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不含腎小球的高倍視野(×400倍),每個(gè)視野分別測(cè)量腎間質(zhì)相對(duì)面積,即腎間質(zhì)面積與統(tǒng)計(jì)場(chǎng)面積的比值。2.7檢測(cè)大鼠抗-多克隆抗體的光密度聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加一抗(兔抗大鼠CD34單克隆抗體、兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體)、二抗,顯色劑顯色,予電泳凝膠成像分析系統(tǒng)照相,測(cè)定其光密度,計(jì)算目的產(chǎn)物與β-actin的光密度比值作為半定量指標(biāo)。2.8-actin上游引物及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度參照文獻(xiàn)的方法提取各組腎組織總RNA。HIF-1α引物:上游引物:5’-TGCTTGGTGCTGATTTGTGA-3’,下游引物:5’-GGTCAGATGATCAGAGTCCA-3’,產(chǎn)物長(zhǎng)度為209bp;β-actin上游引物:5’-CCCTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3’,下游引物:5’-GTTTTCTGCGCAAGTTAGG-3’,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為531bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物定量:在1.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,溴化乙錠染色,電泳凝膠成像分析系統(tǒng)采圖、分析,半定量HIF-1αmRNA的相對(duì)表達(dá)量。3統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),采用單因素方差分析。結(jié)果1細(xì)胞生長(zhǎng)和形態(tài)剛分離的原代細(xì)胞經(jīng)多次全量換液后,未貼壁的細(xì)胞及黏附于貼壁細(xì)胞上的雜細(xì)胞被逐漸清除。貼壁細(xì)胞為散在的集落,大多呈梭形或多角形,大小長(zhǎng)短不一。至15天左右,細(xì)胞的體積亦較剛貼壁時(shí)增大,細(xì)胞呈旋渦狀排列。經(jīng)消化、傳代后,第3代MSCs在24h內(nèi)即可完全貼壁、伸展,呈長(zhǎng)梭形。第5代MSCs生長(zhǎng)迅速,7天即達(dá)完全融合長(zhǎng)滿瓶底。細(xì)胞分布較均勻,為均一的長(zhǎng)梭形成纖維樣細(xì)胞。細(xì)胞鑒定結(jié)果示:第5代MSCsCD29、CD44、CD105陽性率均在95%以上,顯示細(xì)胞均一性較好。根據(jù)以上結(jié)果可以判定最終培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs。2y+細(xì)胞間質(zhì)中y染色體的熒光表達(dá)MSCs移植組腎組織切片可見位于藍(lán)色熒光的細(xì)胞核(DAPI復(fù)染細(xì)胞核)內(nèi)有綠色熒光亮點(diǎn),即Y染色體SRYFISH陽性表達(dá)(Y+)。連續(xù)切片顯示部分Y+細(xì)胞,熒光顯微鏡下可見位于細(xì)胞漿的紅色熒光,即ECs標(biāo)準(zhǔn)物CD34陽性表達(dá)。觀察到Y(jié)+細(xì)胞主要分布在腎臟皮、髓質(zhì)交界部位的腎間質(zhì)。計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野(×400)內(nèi)的Y+細(xì)胞占內(nèi)皮細(xì)胞的比例為5.98%,占總細(xì)胞的1.12%。正常對(duì)照組腎組織切片可見藍(lán)色熒光的細(xì)胞核但沒有發(fā)現(xiàn)黃綠色熒光信號(hào),即Y染色體SRYFISH陰性表達(dá)(Y-)。連續(xù)切片,可見腎間質(zhì)散在分布位于細(xì)胞漿的紅色熒光即CD34陽性。3免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果3.1半徑、伸長(zhǎng)和形態(tài)位于腎間質(zhì)ECs細(xì)胞漿,呈黃褐色。正常對(duì)照組顯示CD34陽性表達(dá)的細(xì)胞在腎間質(zhì)中規(guī)律排列,PTC的半徑、周長(zhǎng)和形態(tài)大體相同。非移植組腎小管萎縮、大面積腎間質(zhì)纖維化區(qū)域內(nèi)可見CD34表達(dá)嚴(yán)重減少甚至完全缺乏,PTC密度減少。MSCs移植組CD34表達(dá)量較正常對(duì)照組減少但較非移植組明顯增加。提示MSCs移植組PTC密度較非移植組顯著增加(P<0.01),但較正常對(duì)照組減少(P<0.01)。3.2腎間質(zhì)細(xì)胞核表達(dá)增加/形態(tài)考察,腎間質(zhì)細(xì)胞核陽性表達(dá),腎間質(zhì)細(xì)胞核散在表達(dá),腎間質(zhì)核酸比位于細(xì)胞胞核,呈棕黃色。正常對(duì)照組無或僅有微量的HIF-1α表達(dá);非移植組HIF-1α表達(dá)顯著增強(qiáng),主要集中在腎小管上皮細(xì)胞核陽性表達(dá),也可見腎間質(zhì)細(xì)胞核散在表達(dá),與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);MSCs移植組,HIF-1α表達(dá)顯著減弱,可見腎小管上皮細(xì)胞核散在陽性表達(dá),與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。4腎間質(zhì)分布及形態(tài)從HE和Masson染色可以看出,正常對(duì)照組腎小管形態(tài)基本正常;非移植組可見大部分腎小管萎縮、管壁斷裂,腎間質(zhì)面積進(jìn)一步擴(kuò)大,出現(xiàn)多灶性纖維化;MSCs移植組腎小管上皮細(xì)胞腫脹,可見炎性細(xì)胞散在分布,腎間質(zhì)纖維化不明顯,較非移植組腎間質(zhì)纖維化面積減小,較正常對(duì)照組腎間質(zhì)面積擴(kuò)大(P<0.05,表1)。5上訴取樣法的結(jié)果表明5.1mscs移植對(duì)cd治療前后條帶顏色和厚度的影響正常對(duì)照組CD34高表達(dá),CD34/β-actin值為0.77±0.05;非移植組,條帶顏色顯著變淺,灰度值顯著變小,呈弱表達(dá),CD34/β-actin值為0.27±0.09,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);MSCs移植組,條帶顏色較非移植組顯著加深,灰度值顯著增強(qiáng),CD34/β-actin值為0.52±0.06,與非移植組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);但顏色仍較正常對(duì)照組變淺、灰度值顯著變小,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。5.2組大鼠-actin值的比較正常對(duì)照組沒有HIF-1α蛋白表達(dá);非移植組HIF-1α條帶表達(dá)顯著增強(qiáng),HIF-1α/β-actin值為0.89±0.05,與正常對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MSCs移植組HIF-1α條帶顏色較非移植組顯著變淺,灰度值顯著降低,HIF-1α/β-actin值為0.29±0.15,與非移植組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。6兩組患者血清中hf-1/-actin值比較正常對(duì)照組腎組織HIF-1αmRNA無表達(dá);非移植組HIF-1α條帶呈增加趨勢(shì),HIF-1α/β-actin值為0.92±0.11較正常對(duì)照組顯著增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。MSCs移植組HIF-1α/β-actin值為0.42±0.09,較非移植組顯著減弱差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ecs的表達(dá)與腎間質(zhì)及cd40的相關(guān)性迄今為止,尚未發(fā)現(xiàn)MSCs的特異性表面標(biāo)志。MSCs的抗原表型不是單一的,而是兼有間質(zhì)細(xì)胞、上皮和肌肉細(xì)胞的特征,主要表達(dá)SH-2(CD105)、CD44、CD29、CD71、CD90等。本研究根據(jù)MSCs具有貼塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁生長(zhǎng)和與其他細(xì)胞的密度不同的特點(diǎn),采取貼壁細(xì)胞分離法與密度梯度離心法結(jié)合的辦法分離MSCs。并在此基礎(chǔ)上,檢測(cè)MSCs抗原表達(dá)情況,最終鑒定所分離、培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs。近年來研究顯示,CAAN在有明顯的腎小管損傷、腎間質(zhì)纖維化之前,PTC已有所減少,且PTC減少與腎間質(zhì)纖維化程度成正相關(guān)。因此,如何解決PTC丟失是治療CAAN的重要環(huán)節(jié)。MSCs具有ECs部分表型,例如MSCs可表達(dá)SH2、vWF因子和內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1,而以上因子ECs上亦有表達(dá)且分別與ECs游走、損傷和活化關(guān)系密切。提示MSCs具有誘導(dǎo)分化成ECs從而修復(fù)PTC的潛在可能。近年來已有體外誘導(dǎo)MSCs向ECs分化的報(bào)道。應(yīng)用MSCs移植分化為ECs的體內(nèi)研究主要集中在心腦血管疾病的治療,干細(xì)胞移植修復(fù)PTC的相關(guān)研究尚罕見報(bào)道。我們應(yīng)用SRYFISH技術(shù)檢測(cè)雌性受體大鼠腎間質(zhì)Y+的雄性供體來源的MSCs,以ECs標(biāo)志物CD34檢測(cè)ECs。CD34是一種高度糖基化的跨膜蛋白,主要表達(dá)在ECs細(xì)胞漿中。新生ECs上有很多微小的卷須狀突起,這種突起像偽足一樣插入血管周圍的基質(zhì)中以實(shí)現(xiàn)ECs的遷移。CD34抗原在血管形成期間參與了ECs的黏附和轉(zhuǎn)移,可以代表ECs分布趨勢(shì),是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的ECs標(biāo)志物。需要指出的是我們不排除MSCs在腎臟通過自發(fā)的細(xì)胞融合表達(dá)ECs表型,但國(guó)外研究表明此種細(xì)胞融合頻率極