第十二章DNA合成

核酸的生物合成

本章重點(diǎn)介紹遺傳中心法則和DNA、RNA的生物合成，對(duì)基因工程作一般介紹。

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DNA是絕大多數(shù)生物體遺傳信息的載體，繼1953年Watson&Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型后，1958年，Crick提出了“(F)中心法則”(Centraldogma)揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。遺傳信息傳遞的中心法則

蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲(chǔ)存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細(xì)胞分裂的過(guò)程中，通過(guò)DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實(shí)地傳遞給兩個(gè)子代細(xì)胞。在子代細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，這些遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過(guò)翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來(lái)人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。

中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動(dòng)規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識(shí)，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類(lèi)的生產(chǎn)和生活帶來(lái)了深刻的革命。目錄第四節(jié)基因工程及分子生物學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)介第一節(jié)DNA的生物合成第二節(jié)DNA重組第三節(jié)

核酸合成的抑制劑第一節(jié)DNA的生物合成

一、DNA的復(fù)制（DNA指導(dǎo)下的DNA合成）三、DNA突變四、DNA的損傷與修復(fù)二、逆轉(zhuǎn)錄作用（RNA指導(dǎo)下的DNA的合成）一、DNA的半保留復(fù)制

1、概念和實(shí)驗(yàn)依據(jù)

DNA合成的通式及方向

2、原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類(lèi)

3、原核細(xì)胞DNA的復(fù)制的起始點(diǎn)和方式5、DNA復(fù)制的忠實(shí)性6、真核細(xì)胞DNA的復(fù)制

4、原核細(xì)胞DNA的復(fù)制過(guò)程F半不連續(xù)復(fù)制)DNA的半保留復(fù)制的概念

DNA在復(fù)制時(shí)，兩條鏈解開(kāi)分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互補(bǔ)的原則合成兩條與模板鏈互補(bǔ)的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來(lái)自親代，另一條鏈?zhǔn)切潞铣傻模@種復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。原核生物DNA聚合反應(yīng)有關(guān)的酶類(lèi)

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引發(fā)體(primosome)

：?jiǎn)?dòng)RNA引物鏈的合成。(3）DNA連接酶（DNAligase）（4）DNA解鏈酶(DNAhelicase)(5）單鏈結(jié)合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：結(jié)合在解開(kāi)的DNA單鏈上，防止重新形成雙螺旋。(6）拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase):兼具內(nèi)切酶和連接酶活力，能迅速將DNA超螺旋或雙螺旋緊張狀態(tài)變成松馳狀態(tài)，便于解鏈。解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB3′3′5′3′5′5′RNA引物復(fù)制的忠實(shí)性

DNA復(fù)制過(guò)程是一個(gè)高度精確的過(guò)程，據(jù)估計(jì)，大腸桿菌DNA復(fù)制109-1010堿基對(duì)僅出現(xiàn)一個(gè)誤差，保證復(fù)制忠實(shí)性的原因主要有以下三點(diǎn):a、DNA聚合酶的高度專(zhuān)一性（嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則）b、DNA聚合酶的校對(duì)功能（錯(cuò)配堿基被3’-5’外切酶切除）c、起始時(shí)以RNA作為引物DNA的半保留復(fù)制實(shí)驗(yàn)依據(jù)

1958年Meselson&stahl用同位素示蹤標(biāo)記加密度梯度離心技術(shù)實(shí)驗(yàn),證明了DNA是采取半保留的方式進(jìn)行復(fù)制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA合成的通式及方向DNA合成是以4種dNTP(N=A,T,G,C)為底物，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3’-OH添加脫氧核苷酸使鏈延長(zhǎng)的過(guò)程。連接酶連接切口Mg2+連接酶ATP或NAD＋PPi或NMNATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板鏈模板鏈大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型DNA復(fù)制的方式環(huán)狀DNA復(fù)制時(shí)所形成的Q結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制原核細(xì)胞DNA的半不連續(xù)復(fù)制復(fù)制過(guò)程

復(fù)制叉的移動(dòng)方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導(dǎo)鏈隨后鏈3′5′復(fù)制的起始DNA鏈的合成與延長(zhǎng)DNA鏈合成的終止5′RNA引物3′3′大腸桿菌有三種DNA聚合酶分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用聚合速度(核苷酸/分)持續(xù)合成能力主要功能PolⅠPolⅡPolⅢ109,000400+++1000-12003-200DNA修復(fù)RNA引物切除120,000100++-24001500DNA修復(fù)400,00010-20+++15000-60000≥500000DNA復(fù)制比較項(xiàng)目DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶ⅢDNApolymeraseI大片段(Klenowfragment)小片段5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用DNA聚合酶Ⅲ全酶

核心酶PolIII

PolIII延長(zhǎng)因子DNA聚合酶Ⅲ二聚體primaseAprimosomeisacomplexofsevenproteins:DnaG

primase,DnaB

helicase,DnaChelicaseassistant,DnaT,PriA,PriB,andPriC.DNALigaseligasefrommanybacteria/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb55_1.html不能催化單鏈DNA連接必須具有粘性末端雙鏈DNA，而不是平齊末端羥基和磷酸基團(tuán)必須相鄰DNAhelicaseIfIwereanenzyme,IwouldbeDNAhelicase,

soIcouldunzipyourgenesSingle-strandedDNAbindingproteinfrom

M.tuberculosis,

M.lepraeandM.megmatis

SSBtopoisomerasecutsonestrandofaDNAdoublehelixandthenreannealsthecutstrand.cutsbothstrandsofoneDNAdoublehelix,passesanotherunbrokenDNAstrandthroughit,andthenreannealsthecutstrandTypeITypeIIDNA聚合酶催化的鏈延長(zhǎng)反應(yīng)3′5′模板鏈5′RNA引物子鏈3′3′5′5′3′3′5′5′3′大腸桿菌三種DNA聚合酶比較DNA聚合酶Ⅱ分子量每個(gè)細(xì)胞的分子統(tǒng)計(jì)數(shù)5′-3′聚合酶作用3′-5′核酸外切酶作用5′-3′核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（復(fù)合物）109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20+++50比較項(xiàng)目DNA聚合酶的3

-5

外切酶水解位點(diǎn)3′3′5′5′錯(cuò)配堿基3′-5′核酸外切酶水解位點(diǎn)復(fù)制叉處前導(dǎo)鏈和隨后鏈同時(shí)合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物體引物體解旋酶解旋酶DNA聚合酶的校對(duì)功能

5′-核酸外切酶3′-核酸外切酶裂縫聚合中心裂縫內(nèi)部DNA聚合酶的校對(duì)功能聚合酶錯(cuò)配鹼基復(fù)制方向正確核苷酸5′5′5′3′3′3′切除錯(cuò)配核苷酸真核細(xì)胞DNA復(fù)制的特點(diǎn)

多個(gè)起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)起點(diǎn)

端粒（telemere）復(fù)制端粒酶（telomerase）DNA復(fù)制需要引物，但在線(xiàn)形DNA分子末端不可能通過(guò)正常的機(jī)制在引物被降解后合成相應(yīng)的片段.如果沒(méi)有特殊的機(jī)制合成末端序列，染色體就會(huì)在細(xì)胞傳代中變得越來(lái)越短。這一難題是通過(guò)端粒酶的發(fā)現(xiàn)才得到了澄清，端粒酶是一種含RNA的蛋白復(fù)合物，實(shí)質(zhì)上是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，它能催化互補(bǔ)于RNA模板的DNA片段的合成，使復(fù)制以后的線(xiàn)形DNA分子的末端保持不變。

初步研究表明，人體中生殖細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度保持不變，而體細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度則隨個(gè)體的老化而逐步縮短。對(duì)此的一個(gè)推論是：人的生殖細(xì)胞具端粒酶的活力，體細(xì)胞則否。這一問(wèn)題的解決無(wú)疑會(huì)有助于對(duì)生命衰老的認(rèn)識(shí)。5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒合成的一種模型3′5′TTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3′5′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3′5′AATTTTG5′3′AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和雜交移位和再雜交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5′3′nAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTCCCCTnAA3′TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5′3′TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn進(jìn)一步加工繼續(xù)延伸真核和原核DNA細(xì)胞復(fù)制比較二、逆轉(zhuǎn)錄作用1、概念2、逆轉(zhuǎn)錄酶3、病毒逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程4、逆轉(zhuǎn)錄的生物學(xué)意義擴(kuò)充了中心法則有助于對(duì)病毒致癌機(jī)制的了解與真核細(xì)胞分裂和胚胎發(fā)育有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶是分子生物學(xué)重要工具酶三種功能依賴(lài)DNA指導(dǎo)下的DNA聚合酶活力依賴(lài)RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H活力

以RNA為模板合成DNA，這與通常轉(zhuǎn)錄過(guò)程中遺傳信息從DNA到RNA的方向相反，故稱(chēng)為逆轉(zhuǎn)錄作用。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中cDNA的合成

依賴(lài)RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴(lài)DNA的DNA聚合酶逆逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活周期

生活周期RNA衣殼被膜逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)譯整合入宿主細(xì)胞染色體DNA進(jìn)入細(xì)胞丟失被膜丟失衣殼逆轉(zhuǎn)錄RNARNAcDNA衣殼蛋白被膜蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶

三、DNA的突變

DNA分子中的核苷酸序列發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變，從而導(dǎo)致DNA的復(fù)制以及后來(lái)的轉(zhuǎn)錄和翻譯產(chǎn)物隨之發(fā)生變化，表現(xiàn)出異常的遺傳特性，稱(chēng)為DNA的突變。它包括由于DNA損傷和錯(cuò)配得不到修復(fù)而引起的突變，以及由于不同DNA分子之間的交換而引起的遺傳重組。二、誘變劑的作用

堿基類(lèi)似物(baseanalog)

堿基修飾劑(basemodifier)

嵌入染料(intercalationdye)

紫外線(xiàn)(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation)一、突變的類(lèi)型

堿基對(duì)的置換(substitution)

移碼突變(framesshiftmutation)

DNA突變的類(lèi)型

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-