第22章-免疫學(xué)檢測技術(shù)

第二十二章免疫學(xué)檢測技術(shù)

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主講：運晨霞第一節(jié)體外抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的特點及影響因素一.體外抗原抗體反應(yīng)的特征

高度特異性：抗原的表位與抗體的抗原結(jié)合點結(jié)構(gòu)互補。

表面化學(xué)基團(tuán)之間的可逆性結(jié)合適宜的抗原抗體濃度和比例抗原抗體反應(yīng)的兩個階段高度專一性的結(jié)合可逆性結(jié)合Equivalence–Latticeformation抗原抗體比例對反應(yīng)現(xiàn)象的影響抗原抗體反應(yīng)的影響因素電解質(zhì)：可促進(jìn)抗原與抗體的結(jié)合。常用生理鹽水。溫度：最適溫度為37℃。酸堿度：最適pH=6-8。第二節(jié)檢測抗原或抗體的體外試驗（一）凝集反應(yīng)顆粒性抗原（RBC、細(xì)菌等）與相應(yīng)抗體結(jié)合形成肉眼可見凝集物的現(xiàn)象或反應(yīng)。1．直接凝集試驗玻片凝集試驗：用于定性測抗原。如ABO血型鑒定，細(xì)菌的鑒定、分型等。試管凝集試驗：用于定量測抗體，如肥達(dá)氏反應(yīng)。

2．間接凝集試驗如類風(fēng)濕因子的測定等。（二）沉淀反應(yīng)

可溶性抗原（血清蛋白、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合而形成可見沉淀物的反應(yīng)。因該類反應(yīng)多在半固體瓊脂凝膠中進(jìn)行，故又稱為瓊脂擴散試驗或免疫擴散。

瓊脂凝膠1．單向免疫擴散用于定量測抗原。如檢測血清免疫球蛋白、C3等含量。

2．雙向免疫擴散主要用于定性檢測抗原或抗體，抗原組成及兩種抗原相關(guān)性分析3．免疫電泳

其方法是先電泳、后擴散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于診斷如骨髓瘤、性聯(lián)低丙種球蛋白血癥等的診斷

（三）免疫標(biāo)記技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)常用的標(biāo)記物酶、熒光素、放射性核素、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)及膠體金優(yōu)點：極大的提高了反應(yīng)的靈敏度，可以對微量物質(zhì)進(jìn)行定量、定性或定位檢測。免疫標(biāo)記技術(shù)主要類型：免疫酶技術(shù)免疫熒光技術(shù)放射免疫測定法發(fā)光免疫分析免疫膠體金技術(shù)1)免疫酶測定法（EnzymeImmunoassay,EIA）利用酶標(biāo)記一抗或二抗檢測特異性抗原或抗體的方法特點：利用抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性，以及酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,最后用酶標(biāo)儀測定光密度值（OD），評定抗原-抗體的含量。常用酶及其底物辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）

分類雙抗體夾心法在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、HCG等特點：非競爭結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇

間接法ELISA乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測常采用本法2)免疫熒光技術(shù)

(ImmunofluorescenceTechnique)

用熒光素標(biāo)記一抗或二抗，檢測特異性抗原或抗體的方法

常用熒光素異硫氰酸熒光素（FITC），顯黃綠色。藻紅蛋白（PE），顯紅色。用途：細(xì)胞表面CD分子抗核抗體

3)放射免疫測定法（RIA）用放射性核素標(biāo)記一抗或二抗，檢測特異性抗原或抗體的方法敏感度可達(dá)pg水平，其標(biāo)記物為125I、131I等。常用于微量物質(zhì)的檢測，如激素、IgE等。

4)發(fā)光免疫分析(luminescenceimmunoassay

LIA)將發(fā)光分析系統(tǒng)和免疫測定相結(jié)合而建立的一種新的超微量免疫分析技術(shù)。優(yōu)點：該方法既具有免疫反應(yīng)的高度特異性又有發(fā)光分析的高靈敏度?；瘜W(xué)發(fā)光免疫測定吖啶酯、魯米諾生物發(fā)光免疫測定螢火蟲、發(fā)光水母化學(xué)發(fā)光酶免疫測定辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）電化學(xué)發(fā)光免疫測定5)免疫膠體金技術(shù)用膠體金標(biāo)記一抗或二抗，檢測特異性抗原或抗體的方法6)免疫印跡法（Westernblotting）該法是將凝膠電泳與固相免疫相接合的檢測技術(shù)，即將電泳分區(qū)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫技術(shù)測定。常用于檢測多種蛋白質(zhì)免疫印跡法示意圖4.蛋白質(zhì)芯片技術(shù)：又稱蛋白質(zhì)微陣列是一種高通量的蛋白功能分析技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，甚至DNA－蛋白質(zhì)、RNA－蛋白質(zhì)的相互作用，篩選藥物作用的蛋白靶點等。原理：是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為檢測的芯片，然后，用標(biāo)記了有特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片作用，與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配的抗體將與其對應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合，抗體上的熒光將指示對應(yīng)的蛋白質(zhì)及其表達(dá)數(shù)量。第三節(jié)免疫細(xì)胞功能的檢測免疫細(xì)胞的分離外周血單個核細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞的分離T細(xì)胞和B細(xì)胞的分離T細(xì)胞亞群的分離(一)外周血單個核細(xì)胞分離外周血單個核細(xì)胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMCs）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞（monocyte）。

Ficoll分離液法主要用于分離外周血中的單個核細(xì)胞，是一種單次差速密度梯度離心的分離法。細(xì)胞分離基本原理不同細(xì)胞密度不同不同細(xì)胞表面生物學(xué)特性不同不同細(xì)胞表面分化抗原不同不同細(xì)胞密度不同人的紅細(xì)胞密度為1.093

粒細(xì)胞密度為1.092

單個核細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）的密度為1.075-1.090

用1.077±0.001的分層液可將細(xì)胞分離密度梯度離心(Ficoll)離心（二）淋巴細(xì)胞及其亞群的分離和分析免疫吸附分離法免疫磁珠法熒光激活細(xì)胞分離儀分離法（

(FluorescenceActivatedCellSorting)，

FACS

）抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)分析CTL

2.免疫磁珠細(xì)胞分離免疫磁珠法細(xì)胞分選過程3.熒光激活細(xì)胞分離儀分離法流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)

全自動細(xì)胞分選系統(tǒng)流式細(xì)胞分析儀流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu)待測細(xì)胞以單個細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動室。流動室充滿IsoFlow

，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機，軟件分析。4.抗原肽-MHC分子四聚體是一種藥品的名字，可應(yīng)用于免疫學(xué)研究和檢測、特異性免疫治療以及疫苗療效監(jiān)測等多個方面抗原肽-MHC分子四聚體技術(shù)分析CTL二細(xì)胞免疫功能檢測T細(xì)胞功能測定B細(xì)胞功能測定（1）T淋巴細(xì)胞增殖試驗原理：淋巴細(xì)胞DNA合成分化母細(xì)胞刺激物細(xì)胞變大細(xì)胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松1）形態(tài)學(xué)檢查法2）3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復(fù)性好。缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。3H-TdR或125I-UdR摻入法3）MTT比色法(2)遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測2.B細(xì)胞功能測定單擴ELISA速率比濁法測定各類免疫球蛋白含量抗體形成細(xì)胞測定（2）溶血空斑試驗原理：臨床應(yīng)用與評價溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。

B細(xì)胞抗體形成功能的檢測

——酶聯(lián)免疫斑點法原理：應(yīng)用與方法學(xué)評價：該方法既可檢測抗體分泌細(xì)胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細(xì)胞。ELISPOT技術(shù)簡介

酶聯(lián)免疫斑點試驗(Enzymelinkedimmunospotassay)

80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和CK分泌細(xì)胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。ELISPOT的基本原理

細(xì)胞受到刺激后局部產(chǎn)生細(xì)胞因子，此細(xì)胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細(xì)胞分解后，被捕獲的細(xì)胞因子與生物素標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與酶標(biāo)記（例如堿性磷酸酶）的親和素結(jié)合。底物（BCIP/NBT，產(chǎn)物為藍(lán)紫色）孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細(xì)胞產(chǎn)生了細(xì)胞因子，通過酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點分析后得出結(jié)果。穩(wěn)定、特異，且抗原用量少可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的抗體分泌，并可定量