第3章：細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)

第三章：細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)：Cyclin:調(diào)節(jié)亞基Cdk(cyclindependentkinase)：催化亞基多種控制細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)活化的方式Cdks與Cyclins的結(jié)合磷酸化與去磷酸化蛋白質(zhì)降解基因表達(dá)調(diào)控CKI的結(jié)合空間分布細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的協(xié)調(diào)G1期：轉(zhuǎn)錄細(xì)胞外（如有絲分裂原）和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)（如細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)控系統(tǒng)）可啟動(dòng)G1/S-和S-細(xì)胞周期蛋白基因的表達(dá)，最終可以激活G1/S-Cdks，新的細(xì)胞周期因此開(kāi)始。G2期：磷酸化與去磷酸化Cdk亞單位的抑制型磷酸化處于無(wú)活性的磷酸狀態(tài)。當(dāng)有絲分裂開(kāi)始時(shí)，這些磷酸化的突然去除導(dǎo)致了所有M-Cdk的激活，觸發(fā)了G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)的轉(zhuǎn)換。M期：蛋白質(zhì)降解破壞S期和M期細(xì)胞周期蛋白——使所有主要Cdks在有絲分裂后半段失活。破壞姐妹染色單體結(jié)合在一起的蛋白——染色體分離。細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的特性：第一，細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)包括反饋環(huán)和其他調(diào)節(jié)的相互作用，使大部分周期蛋白-Cdk復(fù)合物產(chǎn)生不可逆的，開(kāi)關(guān)樣的激活和失活。因此，細(xì)胞周期事件通常是以“全或無(wú)”的方式進(jìn)行，以使細(xì)胞避免一些事件的部分激活造成的傷害。第二，不同周期蛋白-Cdk開(kāi)關(guān)的相互調(diào)節(jié)作用確保它們之間的有序與協(xié)調(diào)。細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的特性：第三，細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)極為強(qiáng)大：每個(gè)周期蛋白-Cdk開(kāi)關(guān)的激活與失活都能通過(guò)多種機(jī)制進(jìn)行調(diào)控，使得系統(tǒng)在即使部分組分出現(xiàn)問(wèn)題的情況下，依然運(yùn)轉(zhuǎn)良好。最后，系統(tǒng)具有可適應(yīng)性，在各種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的調(diào)節(jié)因子的作用下，主要調(diào)控開(kāi)關(guān)的時(shí)間點(diǎn)可以能作出相應(yīng)的調(diào)整。第一節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的蛋白激酶細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶（Cdks）屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族，其成員都是小分子量蛋白質(zhì)(～34-40kDa)所有的Cdks都有一個(gè)共同的特征，即它們酶活性的激活需要結(jié)合細(xì)胞周期蛋白調(diào)節(jié)亞單位。大部分情況，Cdks的完全激活還需要靠近激酶活性位點(diǎn)的蘇氨酸的磷酸化。一、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶的特性動(dòng)物細(xì)胞包括至少九種Cdks，其中只有四種（Cdk1,2,4,6）直接參與了細(xì)胞周期調(diào)控一、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶的特性Cdk功能在進(jìn)化中高度保守。如果把酵母的Cdk1基因替換為人的Cdk1，酵母細(xì)胞依然能正常增殖。Cdks能磷酸化幾百種不同的蛋白質(zhì)。Cdk蛋白識(shí)別的特定序列的絲氨酸或蘇氨酸殘基。Cdks典型的磷酸化序列是[S/T*]PX[K/R]，其中S/T*是指磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸，X代表任意氨基酸，K/R代表堿性氨基酸賴(lài)氨酸（K）或精氨酸（R）。一、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶的特性小的氨基端小葉大的羧基端小葉

一個(gè)大的可彎曲的環(huán)—T-環(huán)或激活環(huán)—從羧基端小葉伸出，可阻止蛋白底物結(jié)合到活性位點(diǎn)縫隙入口處。未激活狀態(tài)下，Cdk活性位點(diǎn)的很多重要氨基酸側(cè)鏈定位不正確，使得ATP的磷酸根定向不利于激酶反應(yīng)。二、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶的結(jié)構(gòu)T-loopPASTAIRE螺旋(也叫α1螺旋)與細(xì)胞周期蛋白直接作用，結(jié)合時(shí)向內(nèi)移動(dòng)，引起與ATP磷酸根作用的殘基重新定向。二、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)激酶的結(jié)構(gòu)第二節(jié)細(xì)胞周期蛋白Cyclin一：細(xì)胞周期蛋白分四類(lèi)細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期過(guò)程中表現(xiàn)出劇烈的濃度變化，以幫助產(chǎn)生Cdk活性的震蕩變化，這是形成細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的基礎(chǔ)。細(xì)胞周期蛋白基因表達(dá)的改變蛋白酶解三個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)；四類(lèi)細(xì)胞周期蛋白:G1,G1/S,S,MG1/S細(xì)胞周期蛋白：在G1期的晚期升高，在S期早期下降

：?jiǎn)?dòng)DNA復(fù)制，中心體復(fù)制S細(xì)胞周期蛋白：在S期升高。負(fù)責(zé)DNA復(fù)制，一次M細(xì)胞周期蛋白：S-G2-M。負(fù)責(zé)有絲分裂紡錘體的裝配，姊妹染色單體在紡錘體上的排列

G1細(xì)胞周期蛋白：濃度并不發(fā)生震蕩變化，而是隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞外生長(zhǎng)調(diào)節(jié)信號(hào)出的存在，在整個(gè)細(xì)胞周期中的濃度逐漸增加。負(fù)責(zé)新細(xì)胞周期的設(shè)定。一：細(xì)胞周期蛋白分四類(lèi)二、細(xì)胞周期蛋白的結(jié)構(gòu)不同的一級(jí)結(jié)構(gòu)：約100個(gè)氨基酸的細(xì)胞周期蛋白盒，與Cdk的結(jié)合和激活必需。相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為細(xì)胞周期蛋白折疊，包括一個(gè)由兩個(gè)緊密的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的核心。每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含五個(gè)alpha螺旋。第一個(gè)五個(gè)螺旋簇對(duì)應(yīng)于保守的細(xì)胞周期蛋白盒。第二個(gè)五個(gè)螺旋簇與第一個(gè)螺旋簇相同，盡管序列相似性有限。細(xì)胞周期蛋白氨基末端區(qū)域的長(zhǎng)度尤其不一樣，包括了細(xì)胞周期蛋白特異的調(diào)控和靶向結(jié)構(gòu)域。S細(xì)胞周期蛋白和M細(xì)胞周期蛋白的氨基末端區(qū)域含有短的降解盒基序，能在有絲分裂期靶向蛋白酶解。二、細(xì)胞周期蛋白的結(jié)構(gòu)第三節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的活性的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)的活性受到多種因素的調(diào)節(jié)使得Cdk2構(gòu)象發(fā)生變化，最明顯的變化發(fā)生在T環(huán)（T-loop）處，Cyclin的結(jié)合也使L12小螺旋轉(zhuǎn)化為β鏈，使后面的T環(huán)發(fā)生重構(gòu)，不再堵塞蛋白底物的結(jié)合位點(diǎn)，而是在縫隙入口處幾乎平坦排列。一、與cyclin的結(jié)合是Cdk活化的基本條件底物的靶向性：Cdks：T-環(huán)與底物的SPXK的保守序列作用。細(xì)胞周期蛋白：疏水斑與底物上的RXL基序作用Cks1：磷酸根結(jié)合袋的存在能使其靶向那些含有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)的靶蛋白。一、與cyclin的結(jié)合是Cdk活化的基本條件決定Cdk的底物特異性。位于cyclin表面稱(chēng)為疏水斑的區(qū)域，與含有互補(bǔ)疏水序列稱(chēng)為RXL（或Cy）的基序的底物以中度親和力結(jié)合。cyclin結(jié)合的也可以將Cdk帶到其底物所在的空間部位。有些cyclin包含有序列信息，能夠靶向自身和它們的Cdk同伴到特定的亞細(xì)胞部位。一、與cyclin的結(jié)合是Cdk活化的基本條件活化磷酸化：不去磷酸化抑制磷酸化：去磷酸化二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開(kāi)關(guān)步驟(1)Cdk的活化磷酸化:Cdk活化激酶（CAK）催化、發(fā)生在鄰近激酶活性位點(diǎn)的蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化。二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開(kāi)關(guān)步驟磷酸化使T環(huán)變平，移向cyclinA，使Cdk和cyclin的相互作用更加穩(wěn)定。Thr160的磷酸化使T環(huán)能夠有效地與含有SPXK保守序列的蛋白底物作用。二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開(kāi)關(guān)步驟(2)Cdk的抑制磷酸化由于Cdks的活化性磷酸化不受去磷酸化的調(diào)控，兩種抑制磷酸化就在調(diào)節(jié)Cdk活性中起著重要作用：一個(gè)是保守的酪氨酸殘基（人Cdks的Tyr15），這存在于所有的Cdks中。附近的蘇氨酸殘基（Thr14）的磷酸化進(jìn)一步阻礙了Cdk的活化。Thr14和Tyr15位于激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)的頂端，它們的磷酸化可能通過(guò)干擾ATP磷酸根的方向而抑制Cdk活性。這些抑制性磷酸化位點(diǎn)的去磷酸化對(duì)cyclin-Cdks的激活至關(guān)重要，是開(kāi)關(guān)樣激活的關(guān)鍵開(kāi)關(guān)位點(diǎn)。二、磷酸化與去磷酸化是控制Cdk活性的開(kāi)關(guān)步驟蛋白激酶Wee1：負(fù)責(zé)Tyr15的磷酸化蛋白激酶Myt1：催化Thr14和Tyr15的磷酸化抑制性位點(diǎn)的去磷酸化由Cdc25家族的磷酸酶來(lái)執(zhí)行。例一：G2/MCdk1開(kāi)關(guān)樣的激活抑制性位點(diǎn)的去磷酸化由Cdc25磷酸酶家族執(zhí)行，Cdc25家族在脊椎動(dòng)物中有三個(gè)成員（Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C）。例一：G2/MCdk1開(kāi)關(guān)樣的激活兩種酶都受到它們有絲分裂底物M期cyclin-Cdk復(fù)合物的調(diào)節(jié)：由M-Cdk導(dǎo)致的磷酸化抑制Wee1而激活Cdc25。因此，在有絲分裂開(kāi)始階段，M-Cdk激活了它自身的激活因子，抑制了自身的抑制因子，形成了正反饋環(huán)來(lái)產(chǎn)生開(kāi)關(guān)樣的Cdk激活。盡管CKI的蛋白氨基酸序列的相似性很小，它們卻擁有一些共同的重要功能特性。第一，CKI主要是S-和M-Cdk復(fù)合物的重要抑制因子，在細(xì)胞中高水平表達(dá)以確保在G1期中不存在任何S-或M-Cdk活性。第二，CKI不能抑制G1/S-Cdks，因此，它們不能阻斷這些激酶在起始檢查點(diǎn)的激活。最后，這些抑制因子最后要被Cdks磷酸化后降解。在G1期的晚期，上升的G1/S-Cdk活性能降解這些抑制因子——以允許S-Cdk在S期開(kāi)始階段被激活。三、CKI對(duì)G1期Cdk活性的抑制動(dòng)物細(xì)胞的CKIs可分類(lèi)為兩大結(jié)構(gòu)家族，對(duì)Cdk的抑制的機(jī)制不同。Cip/Kip家族成員：包括Dacapo和p27，結(jié)合周期蛋白和Cdk復(fù)合物。他們的基本功能是通過(guò)抑制G1/S-和S-Cdks來(lái)阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，但他們也能通過(guò)激活G1-Cdks來(lái)促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)入，INK4家族成員：是絕對(duì)的抑制因子，它們能特異性地針對(duì)Cdk4和Cdk6的單體，通過(guò)減少細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合親和力來(lái)起作用。三、CKI對(duì)G1期Cdk活性的抑制

Cip/Kip蛋白與周期蛋白-Cdk復(fù)合物的兩個(gè)亞單位都結(jié)合p27的細(xì)胞周期蛋白結(jié)合部分與周期蛋白A的疏水斑作用。p27的Cdk結(jié)合區(qū)域與激酶亞單位廣泛地相互作用。這些相互作用完全扭曲和部分拆散了在激酶活性位點(diǎn)上方的氨基端突出結(jié)構(gòu)，也直接阻礙了ATP的結(jié)合位點(diǎn)，完全破壞了酶的催化功能。三、CKI對(duì)G1期Cdk活性的抑制

Cip/Kip蛋白還有助于激活G1激酶Cdk4和Cdk6周期蛋白D和Cdk4或Cdk6在沒(méi)有其他蛋白的情況下結(jié)合并不緊密。Cip/Kip蛋白能通過(guò)與這兩個(gè)亞單位作用而增強(qiáng)它們之間的結(jié)合。三、CKI對(duì)G1期Cdk活性的抑制INK4家族僅僅只是Cdk4和6的抑制因子，優(yōu)先結(jié)合于Cdk單體這些抑制因子能在細(xì)胞周期蛋白結(jié)合位點(diǎn)的相反一側(cè)結(jié)合Cdk的兩個(gè)突出，破壞了ATP的結(jié)合與定向。INK4蛋白也將激酶上部的突出扭曲，使之不適合與細(xì)胞周期蛋白的結(jié)合三、CKI對(duì)G1期Cdk活性的抑制遠(yuǎn)祖真核細(xì)胞的細(xì)胞周期可能只由一個(gè)cyclin-Cdk振蕩器操縱，但現(xiàn)代的真核生物擁有多個(gè)不同的cyclin-Cdk復(fù)合物，它們以固定的順序被激活和失活。這種順序的形成取決于不同cyclin的基因轉(zhuǎn)錄在不同細(xì)胞周期階段順序激活。芽殖酵母大約800個(gè)基因或裂殖酵母蛋白編碼基因的約15%，在細(xì)胞周期中顯示出明顯的表達(dá)變化四、cyclin的水平震蕩由基因表達(dá)調(diào)控在G1期的晚期通過(guò)起始點(diǎn)時(shí)表達(dá)，約300個(gè)成員。包括G1/S細(xì)胞周期蛋白、S期細(xì)胞周期蛋白，以及編碼染色體復(fù)制和其他S期事件所必需酶的基因。G2/M期轉(zhuǎn)換和有絲分裂時(shí)表達(dá)，約120種，包括了編碼M期細(xì)胞周期蛋白的基因。有絲分裂后半段和G1期表達(dá)，大約含110種基因，包括編碼Cdk抑制因子的基因。四、cyclin的水平震蕩由基因表達(dá)調(diào)控G1是細(xì)胞周期中承前啟后的重要時(shí)期，一方面細(xì)胞要清除上一個(gè)周期的各類(lèi)調(diào)節(jié)因子的殘存，為下一次DNA復(fù)制做好準(zhǔn)備；另一方面，為了維持細(xì)胞體積的恒定，細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)機(jī)制必須讓細(xì)胞在這個(gè)時(shí)期大量合成細(xì)胞內(nèi)容物，爭(zhēng)取在下次分裂前細(xì)胞的體積能夠加倍。當(dāng)增大細(xì)胞的體積到一定的閾值時(shí)，就傳遞某種信號(hào)給細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)，不可逆地啟動(dòng)下一個(gè)新細(xì)胞周期的進(jìn)程。例2：G1期Cdk的活性調(diào)控方式G1期Cdk活性的抑制機(jī)制。增加細(xì)胞周期蛋白的降解Cdk抑制蛋白對(duì)Cdk活性的抑制作用減少細(xì)胞周期蛋白基因表達(dá)例2：G1期Cdk的活性調(diào)控方式動(dòng)物細(xì)胞Start檢驗(yàn)點(diǎn)之前，G1/S基因的表達(dá)被抑制型E2F的結(jié)合而抑制。所以Start檢驗(yàn)點(diǎn)G1/S基因表達(dá)的升高依賴(lài)于抑制型E2F從G1/S基因的啟動(dòng)子上去除，并被置換成激活型的E2Fs。這個(gè)過(guò)程依賴(lài)于pRB蛋白質(zhì)的失活。例2：G1期Cdk的活性調(diào)控方式：基因表達(dá)細(xì)胞跨過(guò)Start檢驗(yàn)點(diǎn)，激發(fā)G1/S基因表達(dá)的關(guān)鍵是pRB的磷酸化。pRB蛋白是細(xì)胞周期的主要?jiǎng)x車(chē)機(jī)制，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2F，抑制了E2F的轉(zhuǎn)錄激活功能。例2：G1期Cdk的活性調(diào)控方式：基因表達(dá)周期蛋白D-Cdk復(fù)合物只催化了部分pRB的磷酸化和E2F的激活。E2F的完全激活只有在G1期的末段G1/S-Cdk：周期蛋白E-Cdk2的活性升高并完成pRB蛋白的磷酸化作用后。正反饋例2：G1期Cdk的活性調(diào)控方式：基因表達(dá)一個(gè)細(xì)胞周期事件向下一個(gè)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換是單向的并且是不可逆的，這個(gè)不可逆性可以通過(guò)Cdk激活的不可逆性來(lái)部分實(shí)現(xiàn)，更重要的保證是cyclin的降解。有絲分裂cyclin降解保證了有絲分裂的退出，也使Cdk活性在G1期維持低的狀態(tài)。周期蛋白，CKI和其他細(xì)胞周期調(diào)控因子通過(guò)泛素化途徑被定向降解。泛素化經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)中完成—泛素激活，泛素偶聯(lián)和泛素—蛋白連接作用，泛素化的蛋白質(zhì)最后被稱(chēng)為蛋白酶體（proteasome）的巨大蛋白酶復(fù)合體識(shí)別并降解。五、蛋白質(zhì)降解控制了細(xì)胞周期的單向性泛素活化酶（E1）：將泛素轉(zhuǎn)移到一個(gè)泛素結(jié)合酶家族成員（E2）上。E2與靶向特異性泛素連接的酶（E3）合作，催化泛素活化的甘氨酸羧基端與靶蛋白的賴(lài)氨酸側(cè)鏈形成肽鍵。被26S蛋白酶體識(shí)別，降解泛素化蛋白成短肽。泛素-蛋白連接酶通常在泛素化機(jī)制中是最重要的調(diào)節(jié)靶蛋白，一方面是因?yàn)樗鼈冊(cè)诜核鼗^(guò)程中是靶蛋白特異性的主要決定因素，另一方面是因?yàn)樗鼈兪谴呋撨^(guò)程的限速步驟。G1/S轉(zhuǎn)換:關(guān)鍵的泛素-蛋白連接酶是稱(chēng)為SCF的一種酶，它的命名來(lái)源于其三個(gè)中心成分——Skp1,cullin和F-盒。中后期轉(zhuǎn)換:關(guān)鍵的泛素-蛋白連接酶為后期促進(jìn)因子（APC）或cyclosome。5.蛋白質(zhì)降解控制了細(xì)胞周期的單向性有絲分裂后半段事件主要受到兩種機(jī)制的調(diào)控：APC介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解作用和Cdk1磷酸化底物的去磷酸化作用。APC控制了細(xì)胞周期調(diào)控檢查點(diǎn)的啟動(dòng)：中期—后期轉(zhuǎn)換檢查點(diǎn)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入中期時(shí)，姐妹染色單體的分離被強(qiáng)大的抑制系統(tǒng)阻止。而當(dāng)姐妹染色單體一旦完成雙指向整列，這些“剎車(chē)系統(tǒng)”就被泛素蛋白連接酶APCCdc20酶解去除。APCCdc20將蛋白質(zhì)泛素化修飾，使之被定向酶解，進(jìn)而發(fā)動(dòng)不可逆轉(zhuǎn)的后期進(jìn)程，并退出有絲分裂。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉(zhuǎn)化當(dāng)細(xì)胞到達(dá)中期時(shí)，M-Cdks通過(guò)磷酸化APC核心亞單位激活了APC，這增強(qiáng)了與Cdc20的結(jié)合。然后APCcdc20靶向降解安全子和M期細(xì)胞周期蛋白，從而滅活M-Cdks。因此，M-Cdks觸發(fā)了導(dǎo)致自身最終降解的系列事件，形成一個(gè)負(fù)反饋環(huán)。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉(zhuǎn)化APCCdc20觸發(fā)了兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)控蛋白的泛素化和酶解：第一，securin的酶解釋放出蛋白酶分離酶（separase），切割黏連蛋白的Scc1亞基，打破姐妹染色單體之間的黏合；第二，有絲分裂cyclin的酶解導(dǎo)致很多Cdk靶蛋白的去磷酸化，這為有絲分裂后半段事件的發(fā)生所必需。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉(zhuǎn)化例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉(zhuǎn)化

不同的激活因子決定APC的底物特異性APC的激活因子有兩種：Cdc20和Cdh1。有絲分裂的前半段和后半段的開(kāi)始時(shí)，Cdh1被Cdk磷酸化，與APC的結(jié)合被抑制。此時(shí)APC結(jié)合Cdc20，其底物主要為S，M期cyclin和securin。有絲分裂中期Cdk的失活使APC與Cdh1去磷酸化，從而導(dǎo)致APC與Cdc20結(jié)合下降而與Cdh1親和力增加，形成的APCCdh1的其中一個(gè)靶蛋白又是Cdc20，這樣就徹底關(guān)閉APCCdc20的功能。同時(shí)APCCdh1決定了其他不被APCCdc20識(shí)別蛋白質(zhì)的酶解，如有絲分裂蛋白激酶Plk和AuroraA。所以Plk和AuroraA的降解的時(shí)間要晚于cyclinB-Cdk1，這對(duì)有絲分裂的退出至關(guān)重要。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期轉(zhuǎn)化2．抑制因子決定了APC激活的時(shí)間一個(gè)叫Emi1的蛋白質(zhì)在G2期和有絲分裂的前半段與Cdc20結(jié)合，并可能阻礙其與APC的相互作用而抑制了APC的活化。在前期的末段，Emi1可以同時(shí)被Plk和cyclinB-Cdk1復(fù)合物磷酸化，為泛素蛋白連接酶SCFb-TrCP1所識(shí)別，導(dǎo)致Emi1在前中期被酶解，釋放出Cdc20，形成有活性的APCCdc20。Emi1水平在G1期結(jié)束時(shí)再次升高，抑制了APCCdh1的活性。例3，APC控制的蛋白降解：中/后期