漆酶介體系統(tǒng)處理尾葉桉硫酸鹽漿生物漂白

漆酶介體系統(tǒng)處理尾葉桉硫酸鹽漿生物漂白

傳統(tǒng)砂漿漂白中使用的浮白劑之一是氯。氯可以很好地去除殘余的木素，而氯和多氯優(yōu)雅的化合物是深層、有毒和可導致副作用的材料。因此,由造紙漂白車間排出的廢水對自然環(huán)境造成嚴重污染,危害人類的生存安全。由于人們環(huán)保意識的加強,環(huán)境對制漿造紙工業(yè)的壓力越來越大,市場對紙的需求也發(fā)生了變化,特別是對各種食物包裝的需要。近年來,研究無元素氯和完全無氯漂白在國際范圍迅速展開,各種技術的發(fā)展也很快。發(fā)展生物技術漂白紙漿,是國際上近年來研究的熱門課題。生物漂白就是利用微生物或者其分泌的酶處理紙漿,達到脫除木素或有利于脫木素,并改善紙漿的可漂性或提高紙漿白度的過程。Viikari等利用半纖維素酶預處理紙漿,不僅可以減少化學藥品的用量,降低污染,而且可以提高紙漿的白度,改善紙漿的質(zhì)量,并且有利于進行無元素氯漂白。但是半纖維素酶不能直接降解漿中殘余木素,不能從根本上解決殘余木素的脫除問題。利用微生物(白腐菌)直接作用于紙漿,也可以脫除殘余木素達到漂白的效果。Paice等人用蕓芝(C.versicolor)處理闊葉木硫酸鹽漿,5天后白度提高15%ISO,卡伯值下降3.7個單位;Fujita用白腐菌IZU-154漂白闊葉木硫酸鹽漿,5天后白度提高21%ISO,卡伯值下降20.6個單位。經(jīng)白腐菌處理后,再經(jīng)其他無氯漂白程序,可以得到高白度的紙漿。但是直接用活體菌還存在作用周期長,紙漿需經(jīng)滅菌等問題,不利于工業(yè)生產(chǎn)。利用木素降解酶的生物漂白顯得特別有利,因為它能直接作用于漿中的殘余木素,使之降解。到目前為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的木素降解酶有,木素過氧化物酶(Lip)、錳過氧化物酶(Mnp)和漆酶(Laccase)。在這三種酶中,漆酶被認為是在紙漿漂白工業(yè)中最具有應用前景的酶。近年,國際上有許多關于漆酶在作為電子傳遞的介體(mediator)參與下進行生物漂白的報道。一般認為,漆酶/介體脫木素過程中存在一個氧化還原循環(huán),即漆酶氧化介體形成小分子自由基,并擴散到紙漿中,然后與紙漿中的木素反應,使之降解,達到漂白的目的。此漆酶/介體反應體系中,沒有介體存在時漆酶不能使木素降解,甚至發(fā)生聚合,因此介體起重要作用。目前發(fā)現(xiàn)最有效的介體有2,2’-連氮-二(3-乙基噻唑-6-磺酸)(簡稱ABTS)和1-羥基-苯并三唑(簡稱HBT)。最近,發(fā)現(xiàn)另一種含N-OH的新的化合物N-羥基-乙酰苯胺(NHA)在漆酶生物漂白中具有更好的效果。我們利用從白腐菌產(chǎn)生的漆酶與新的介體NHA構(gòu)成LMS(Laccase-MediatorSystem)體系,進行尾葉桉紙漿的生物漂白研究。1原料和實驗方法1.1木片的制備尾葉桉(Eucalptusurophylla)木片由廣東省雷州林業(yè)局提供,分別用常規(guī)硫酸鹽蒸煮(CK)法和深度脫木素改良硫酸鹽連續(xù)蒸煮(EMCC)法蒸煮獲得紙漿。1.1.1蒸煮條件確定蒸煮器為計算機控制的蒸煮鍋(M/K609-2-10),美國M/KSYSTEMS公司制造。CK漿蒸煮條件為:裝鍋量1000g(絕干),用堿量17%(以NaOH計),硫化度30%,液比1∶4。最后得CK漿的卡伯值為21。EMCC漿蒸煮條件為:液比1∶4,浸漬區(qū)加入白液用堿量10%,順流蒸煮區(qū)加入白液用堿量5%,逆流蒸煮區(qū)補加白液濃度33.8g/L。最后得EMCC漿的卡伯值為15.1。1.1.2制備nh-pcr反應實驗條件:絕干漿100g裝于氧漂鍋,調(diào)節(jié)漿濃為10%,NaOH用量2%,MgSO4用量0.5%,溫度90℃,氧氣壓力1MPa,反應1h。最后EMCC-氧脫木素漿卡伯值為10.9。1.2油漆酶1.2.1引起的氧化酶白腐菌(Panusconchatus)固體發(fā)酵20d,制取粗酶液,然后分離純化,得到純化漆酶。1.2.2吸光度的變化漆酶活力的測定是以ABTS為底物,測定氧化的ABTS在420nm的吸光度變化來確定。一個漆酶酶活單位定義為漆酶在1min內(nèi)氧化1μmolABTS,氧化的ABTS的摩爾吸光度為3.6×104L/(mol·cm)。1.3介質(zhì)體N-乙?；诫?NHA)按文獻的方法自行合成。1.4油漆介體系統(tǒng)lms處理紙漿和過氧化氫漂白1.4.1由朱姆處理紙漿桉木硫酸鹽漿,在適量漆酶與介體存在下,通入氧氣,控制適當?shù)臏囟冗M行反應。1.4.2堿抽提料漿料經(jīng)L/M處理后,用去離子水洗凈,對漿料進行堿抽提。條件為:漿濃為10%,NaOH用量2%,在70℃恒溫下作用90min,處理完后取出漿料,用去離子水洗凈。1.4.3edta螯合法經(jīng)漆酶/NHA催化體系氧化后的紙漿或經(jīng)堿抽提的紙漿,在漿濃10%,pH6.5,50℃條件下與1.0%(絕干漿,下同)EDTA螯合處理30min,然后用去離子水洗滌。再調(diào)節(jié)漿濃為10%,加入NaOH2.0%,過氧化氫2.0%,以及硫酸鎂0.5%和EDTA0.2%,在90℃下反應4h,即進行過氧化氫漂白。1.5紙分析紙漿的白度、粘度和卡伯值按文獻標準方法進行測定。2結(jié)果和討論2.1基于桉木/介體生物漂導劑的生物活性工藝漆酶在介體的存在下與紙漿殘余木素的反應是一個復雜的有機反應過程,為了確立漆酶/介體生物漂白的優(yōu)化工藝條件,我們以桉木EMCC漿作為原料,從漆酶和介體的用量,酶催化反應體系的溫度、pH值,體系的氧氣壓力以及反應時間進行探索。2.1.1漆酶/介體l/m處理脫木素施工實驗主要參數(shù)漆酶在生物漂白過程中很關鍵,它的用量對紙漿的生物漂白脫木素程度將有直接影響。雖然漆酶在反應中作為生物催化劑,但是隨著反應的進行,有可能會使部分漆酶失活,因此漆酶太少,達不到充分脫除木素,就會影響紙漿的白度。當然我們期望能在使用少量漆酶的情況下使紙漿獲得較佳的性能,為了達到此目的,有必要探索較佳的漆酶用量。在實驗中對漆酶用量分別為1U/g漿、2.5U/g漿和5U/g漿幾種條件下進行漆酶/介體(L/M處理)脫木素反應的探索,分析紙漿中卡伯值的變化情況,并對L/M處理后的紙漿再進行堿抽提,以及過氧化氫漂白,比較紙漿的粘度和白度,結(jié)果如圖1和圖2(實驗的具體反應條件在圖2下方)。從圖1可以看出,漆酶的用量為2.5U/g漿時,已達到脫木素的效果,不管是測定未經(jīng)堿抽提(即L/M),還是經(jīng)堿抽提(即L/ME)紙漿的卡伯值,不會因增加漆酶用量而明顯降低。如圖2所示,紙漿經(jīng)L/ME處理后,再經(jīng)QP漂白,隨著漆酶用量的增加,紙漿的粘度有所降低,但漿的白度增加。在漆酶處理時,與漆酶用量為1.0U/g漿比較,漆酶用量為2.5U/g漿和5U/g漿的紙漿經(jīng)QP漂白后的粘度降低不多。但漿的白度增加明顯,當漆酶用量為2.5U/g漿時,紙漿再經(jīng)QP漂白的白度,比漆酶用量為1.0U/g漿提高15%ISO。因此,在漆酶/NHA生物漂白體系中,漆酶的用量選用2.5U/g漿。2.1.2nha用量的影響NHA是漆酶漂白系統(tǒng)中的介體,在漆酶和木素間起傳遞電子作用,即漆酶氧化介體形成小分子自由基,并擴散到紙漿中,然后與紙漿中的木素反應,發(fā)生電子轉(zhuǎn)移,在木素中形成自由基,然后木素自由基發(fā)生一系列的非酶反應,使木素發(fā)生降解,達到漂白的目的。因此適量的介體可以提高漆酶的利用率。選用NHA用量分別為絕干漿的0%、0.1%、0.5%、1%、2%進行實驗。分析紙漿中卡伯值的變化以及過氧化氫漂白后的粘度和白度,實驗結(jié)果見圖3和圖4(實驗的具體反應條件在圖4下方)。圖3表明在不同用量的NHA條件下,紙漿經(jīng)L/M或L/ME處理后的卡伯值變化。結(jié)果表明,當NHA用量小的時候,在生物處理過程中,增加NHA用量,可使?jié){的卡伯值明顯下降,但在NHA用量達1%之后,卡伯值基本上持平。也就是說,在相同的處理條件下,介體NHA用量達到1%足以使木素降解到最少。圖4反映經(jīng)L/M處理然后經(jīng)過氧化氫漂白后紙漿的粘度和白度變化。從圖中可以看出,介體用量增加,經(jīng)L/MEQP漂白后紙漿的粘度略有降低。經(jīng)L/MEQP漂白后紙漿的白度在NHA用量為0.1%～2.0%間有較大提高,但相差不大,其中以NHA用量為1%時白度最高。綜合考慮,NHA用量為1%時,卡伯值最低,白度較高,故選用1%NHA用量較為適宜。2.1.3最佳ph值的確定對于酶參與的生物化學反應,pH值的影響是一個重要因素。適當?shù)膒H值有利于提高漆酶的反應活性,漆酶在最佳pH條件下,可以最大程度降低紙漿中木素的含量,并使紙漿獲得較佳的性能。分別選用pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0幾種條件,進行漆酶/介體(即L/M處理,具體反應條件在圖6下方)脫木素反應的探索,然后分析紙漿卡伯值的變化,并對L/M處理后的紙漿再進行堿抽提,以及過氧化氫漂白,比較紙漿的粘度和白度,以獲得漆酶生物漂白的最佳pH值。從圖5可以看出,在pH4～8范圍內(nèi),pH值為5時,漿的卡伯值最低,說明此pH值下漆酶與NHA構(gòu)成的催化體系脫木素能力最強。降低或升高pH值,紙漿卡伯值均增加。其實不同的介體,反應的最佳pH值不盡相同,如漆酶與ABTS的最佳pH值為4。從圖6可以看出,pH值為5時,白度最高;而pH值為6時,紙漿的粘度最高,而白度相差不大,所以pH值選擇5～6較佳。2.1.4可加堿處理時煤系過氧化氫漂從紙漿漂白工藝上講,反應時間過長是不合適的,然而如果時間不夠,漆酶與木素反應不完全,達不到充分脫木素效果。為此對漆酶/介體系統(tǒng)與紙漿作用不同時間的脫木素效果,以及生物處理后接著進行過氧化氫漂白紙漿的白度和粘度進行比較。結(jié)果見圖7和圖8(實驗的具體反應條件在圖8下方)。從圖7可以看出,紙漿卡伯值隨生物處理時間延長而下降,當L/M處理4h以上,紙漿的卡伯值基本上穩(wěn)定在11.0左右,經(jīng)堿處理后,下降幅度也基本差不多。從圖8可以看出,L/M處理時間超過2h后,粘度值基本穩(wěn)定。紙漿的白度經(jīng)L/M處理2h后,能達到80%ISO以上。延長生物處理時間,白度有所增加,但是增加的幅度并不大,為了降低紙漿的卡伯值,生物處理時間在2h以上較為合適。2.1.5生物處理溫度對于生物酶的反應,溫度是一個非常重要的因素。太低的反應溫度可能使反應時間延長或者反應不完全,太高的溫度可能使生物酶失活或者引發(fā)其他副反應。本研究漆酶/介體處理所選用的溫度分別為40℃、50℃、60℃和70℃,以探索較佳的生物反應溫度。結(jié)果見圖9和圖10(實驗的具體反應條件在圖10下方)。圖9表明紙漿經(jīng)L/M處理以及堿抽提后紙漿卡伯值的變化,L/M處理溫度為50℃時,卡伯值下降得最多,說明在此溫度進行漆酶/介體脫木素較為有利;L/M處理溫度較低時,可能是由于反應速度慢,紙漿中的木素未充分脫除,所以卡伯值較高;L/M處理溫度較高時,有可能會使酶部分失活,脫木素能力下降,紙漿的卡伯值也會偏高。從圖10可以看出,生物處理溫度為40℃到70℃時,經(jīng)L/MEQP漂白后紙漿的粘度相差并不大,但生物處理溫度為50℃時,白度最高。因此,從紙漿的卡伯值、粘度和白度幾方面綜合考慮,L/M生物處理溫度為50℃較佳。2.1.6通氣溫度對卡伯值的影響為了探索氧氣在反應體系中的作用大小,以及可否用空氣代替氧氣,對此進行了系統(tǒng)實驗。L/M處理的實驗條件:漿濃10%,NHA用量1%,漆酶用量2.5U/g漿,pH5.0,溫度為50℃,反應時間2h。圖11顯示各種通氣條件下卡伯值的變化。首先用氮氣將體系中的氧氣排盡,然后在基本無氧的條件下進行反應,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不能發(fā)生脫木素反應,說明漆酶的反應是好氧條件。在漆酶/介體的反應體系僅通空氣,亦能使紙漿發(fā)生脫木素反應,但是脫木素的程度比通氧氣條件時差。圖12顯示經(jīng)過氧化氫漂白后紙漿的粘度和白度,結(jié)果表明,各種處理條件下紙漿的粘度變化并不大,隨著氧氣的壓力增大,紙漿的白度增高,當氧氣的壓力達到0.1MPa后,紙漿漂成高白度,達80%ISO以上,氧氣壓力為0.3MPa時,紙漿的白度最高。2.2不同程序?qū)Χ節(jié){硬度的影響為了考察漆酶/介體生物催化體系對于不同硬度紙漿的脫木素情況,選用尾葉桉常規(guī)硫酸鹽蒸煮硬度較高的CK漿(卡伯值21),和硬度較低的經(jīng)氧脫木素后的EMCC漿(卡伯值10.1),利用漆酶/介體(NHA)/氧氣體系對紙漿進行生物氧化處理,將漆酶氧化處理后的紙漿進行堿抽提,然后用堿性過氧化氫漂白。進行上述處理后,其不同階段的紙漿卡伯值變化見表1、圖13和圖14。圖13和圖14表明,兩種不同硬度的紙漿經(jīng)上述序列處理,紙漿卡伯值變化趨勢類似。但是高硬度的紙漿經(jīng)漆酶氧化處理,卡伯值的下降程度大于低硬度的紙漿。CK漿經(jīng)漆酶/NHA處理,卡伯值能降低17%,再經(jīng)堿抽提后卡伯值降低34.8%;而EMCC氧脫木素漿經(jīng)漆酶/NHA處理,卡伯值僅下降6.9%。比較各種程序經(jīng)過氧化氫漂白后的卡伯值發(fā)現(xiàn):低硬度的漿終卡伯值更低;并且經(jīng)L/MEQP處理后的卡伯值最低,但是與其他處理的差別不十分明顯。然而紙漿白度的變化比較明顯(圖15,16),對于CK漿,經(jīng)L/MQP程序漂白,白度從38.1%ISO提高到81.7%ISO,氧脫木素-EMCC漿的白度從50.2%ISO提高到87.6%ISO,達到了高白度。此研究中最有趣的結(jié)果是,無論對高卡伯值的CK漿,還是低卡伯值的氧脫木素-EMCC漿,漆酶/介體氧化處理后直接進行QP處理,即經(jīng)L/MQP漂白后紙漿的白度比L/MEQP程序漂白的白度更高。然而許多的同類研究中,經(jīng)漆酶/介體處理后需要經(jīng)過堿抽提,然后進行過氧化氫漂白。Poppius-Levlin利用漆酶/HBT處理松木硫酸鹽漿,包括常規(guī)漿和氧脫木素漿,其結(jié)果也是氧脫木素后的紙漿最后白度更高。但是其L/MQP漂白較L/MEQP漂白紙漿的