浙大生化實(shí)驗(yàn)二

專業(yè)：生物科學(xué)專業(yè)：生物科學(xué)姓名：學(xué)號：日期：地點(diǎn)：裝訂線課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲）指導(dǎo)老師：成績：__________________實(shí)驗(yàn)名稱：蔗糖酶蛋白含量測定及活力測定實(shí)驗(yàn)類型：生化實(shí)驗(yàn)同組學(xué)生姓名：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填） 五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理 七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；2、掌握分光光度法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確測定未知樣品的蛋白質(zhì)含量；3、掌握分光光度計(jì)的使用方法。4、掌握酶活力測定的基本原理和方法；5、學(xué)習(xí)酶的比活力的計(jì)算。二、實(shí)驗(yàn)基本原理Folin-酚測定法是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，F(xiàn)olin-酚試劑是由甲、乙兩種試劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀鈉組成，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅色絡(luò)合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成，在堿性條件下，銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物以及蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基（酚基）和色氨酸還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（乙試劑）產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物），其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比?？捎?00nm波長比色測定，適于測定蛋白質(zhì)含量0.05～0.5g/L.

優(yōu)點(diǎn)：簡單、迅速、靈敏度高；反應(yīng)較穩(wěn)定。

缺點(diǎn)：該反應(yīng)受多種因素的干擾。蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2－糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測定有多種方法，例如：納爾遜－索模吉（Nelson-Smogyi）試劑比色法，斐林試劑法等。本實(shí)驗(yàn)采用3.5－二硝基水楊酸法測定還原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度。其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。因此可利用分光光度計(jì)在500nm進(jìn)行比色測定，求得樣品中的含糖量。此法操作簡便、迅速、雜質(zhì)干擾較小。蔗糖酶活力單位(u)：蔗糖酶在室溫(50℃）,pH4.5的條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。蔗糖酶比活力的計(jì)算：酶的比活力——為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示。酶的比活力在酶學(xué)研究中用來衡量酶的純度，對于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力，是表示酶的純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)。

比活力——酶的總活力單位數(shù)除以總蛋白mg數(shù)，即每mg蛋白所含有的酶活力單位數(shù)。比活力＝活力單位/mg蛋白三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料蔗糖酶樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ2、實(shí)驗(yàn)試劑蛋白含量測定：⑴標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.5g/L牛血清白蛋白⑵Folin-酚試劑①甲試劑②乙試劑酶活力檢測①3,5－二硝基水楊酸試劑；甲液：溶解6.9g結(jié)晶酚于15.2ml10％NaOH溶液中，并用水稀釋至69ml,在此溶液中加6.9g亞硫酸氫鈉。乙液：稱取255克酒石酸鉀鈉加到300ml10%NaOH溶液中，再加入800ml1%3,5-二硝基水楊酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黃色試劑,貯于棕色瓶中備用,在室溫放置7-10天以后使用。②1g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(葡萄糖相對分子量198.17）；③5％蔗糖溶液；④0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5；四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器1、試管及試管架；2、可見光分光光度計(jì)及1cm玻璃比色皿；3、恒溫水?。?5℃、50℃、100℃）；4、可見光分光光度計(jì)、1cm玻璃比色皿；5、試管、試管架；6、移液管；7、微量移液器：200μl、1000μl；五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟（一）蛋白質(zhì)含量測定1、制備Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支試管，編號1－6，按表1順序依次加入各種試劑，并在分光光度計(jì)于500nm處測定光吸收值（A520nm值）。2.各步分離純化的蔗糖酶蛋白測定由于蔗糖酶提取、分離純化的各個(gè)樣品的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量較高，因此在測蔗糖酶提取分離純化樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量以前，可根據(jù)各樣品溶液的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量高低不同作適當(dāng)?shù)南♂?，以測定蔗糖酶蛋白質(zhì)含量A500nm值在蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以內(nèi)為宜。取13支試管，編號1～13，按表2依次加入各種試劑，并在分光光度計(jì)于500nm處測定光吸收值（A500nm值）。3.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算⑴繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以光吸收值（A500nm）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg/L）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑵計(jì)算：蔗糖酶提取分離純化的樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀釋溶液的光吸收值（A500nm），查蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得蔗糖酶蛋白含量，再進(jìn)行樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最終蔗糖酶蛋白含量的計(jì)算。（二）酶活力測定1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作按下表加操作：以還原糖（mg數(shù)）為橫坐標(biāo)，A540值為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖濃度－吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.蔗糖酶的酶活力測定按下表加樣：六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（一）蛋白濃度該步實(shí)驗(yàn)由同組同學(xué)所做。（二）酶的活力試管號12345678910111213A5400.0000.0100.0530.2110.0120.0430.1670.0260.0820.2410.0050.0100.080由標(biāo)準(zhǔn)曲線及上表可得試管4,7,10,13中還原糖含量分別為0.018mg，0.110mg，0.163mg，0.028mg。經(jīng)計(jì)算，可得總表如下。分析：1、