股骨頸骨折后股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞凋亡及bcl-2表達(dá)的關(guān)系

股骨頸骨折后股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞凋亡及bcl-2表達(dá)的關(guān)系

股骨頸骨折是一種常見的骨損傷。主要并發(fā)癥是骨折不全和股骨頭壞死，其中股骨頭壞死風(fēng)險(xiǎn)高。筆者運(yùn)用免疫組化技術(shù)對(duì)股骨頸骨折患者30d以內(nèi)股骨頭標(biāo)本分組進(jìn)行Bcl-2檢測(cè),并進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察,同時(shí)采用原位末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)骨細(xì)胞的凋亡情況,探討股骨頸骨折后股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞凋亡對(duì)股骨頭壞死的影響及其病理機(jī)制。1臨床數(shù)據(jù)和方法1.1骨折時(shí)間和性別分布患者共60例,其中男19例,女41例;年齡50～70歲,平均65.7歲。排除腫瘤性疾病和長期臥床患者。骨折均為外傷所致,均在骨折后30d以內(nèi)。據(jù)骨折時(shí)間長短分為早、中、晚期組:早期組(3～10d),男5例,女15例;中期組(10～20d),男8例,女12例;晚期組(20～30d),男6例,女14例。1.2空骨陷窩所占比例的確定股骨頭負(fù)重區(qū)沿冠狀面剖開,冠狀面切取2mm厚組織做石蠟切片,用40g/L多聚甲醛(pH=7.2),100g/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)Tris-HCl脫鈣,多聚賴氨酸處理玻片做HE染色,切片上隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)骨細(xì)胞計(jì)算空骨陷窩所占百分比。1.3抗人單克隆抗體標(biāo)本5μm石蠟切片,多聚賴氨酸處理玻片做PV-9000免疫組化染色,具體步驟參照試劑盒說明進(jìn)行。Bcl-2鼠抗人單克隆抗體及PV-9000試劑盒均為北京中山公司產(chǎn)品。用已知陽性切片作為陽性對(duì)照,用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。二甲基聯(lián)苯胺(DAB)染色,蘇木素對(duì)比染色。Bcl-2表現(xiàn)為細(xì)胞漿陽性。判斷標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)<1%為陰性(-),1%～5%為(+),6%～25%為(++),≥25%為(+++)。1.4陽性細(xì)胞的檢測(cè)采用TUNEL法,試劑盒購自北京中山公司,實(shí)驗(yàn)步驟參照說明書。試驗(yàn)設(shè)陽性與陰性對(duì)照,當(dāng)胞核出現(xiàn)黃色顆粒為陽性細(xì)胞(即凋亡細(xì)胞)。結(jié)果觀察:每張玻片隨機(jī)選擇10個(gè)區(qū)域,每個(gè)區(qū)域計(jì)數(shù)50個(gè)骨細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)出凋亡細(xì)胞數(shù),即為每500個(gè)細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡數(shù)。1.5患者股骨空骨陷窩計(jì)數(shù)及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,不同組別股骨頭空骨陷窩計(jì)數(shù)及凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)以xˉ±sxˉ±s表示,采用t檢驗(yàn);免疫組化染色表達(dá)采用等級(jí)分組資料H檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1骨細(xì)胞消失或凋亡各組股骨頭外觀正常。早期組大部分股骨頭軟骨下呈缺血壞死改變,髓腔內(nèi)各種細(xì)胞消失,大部分骨細(xì)胞胞核消失,骨陷窩空虛,仍可見部分殘存的骨細(xì)胞,骨小梁形態(tài)大致正常。中期組骨細(xì)胞絕大部分胞核消失,骨陷窩空虛化,骨小梁部分吸收,可見少量新生血管。晚期組骨細(xì)胞胞核均消失,僅見空骨陷窩(圖1),部分骨小梁邊緣可見成骨細(xì)胞及新生血管。在不同組中均可見到凋亡的骨細(xì)胞,其特征是核固縮、染色質(zhì)深染濃集、核碎裂,形成凋亡小體(圖2)。不同時(shí)間股骨頭骨細(xì)胞空骨陷窩計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。2.2免疫組化的結(jié)果Bcl-2在各組標(biāo)本中均見表達(dá),但以中期組表達(dá)明顯(圖3),結(jié)果見表2。TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞結(jié)果見圖4、表3。3骨髓松茸與細(xì)胞凋亡股骨頸骨折是一種常見的骨損傷,其主要的并發(fā)癥是骨折不愈合和股骨頭壞死。由于現(xiàn)代股骨頸骨折復(fù)位固定技術(shù)的進(jìn)展,骨折不愈合率已明顯降低,而股骨頭壞死率仍然很高。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的兩種方式之一。它與細(xì)胞壞死不同,具有特征性的形態(tài)改變和生化改變。老年人股骨頸骨折與骨質(zhì)疏松有關(guān),而骨質(zhì)疏松本身與骨內(nèi)細(xì)胞凋亡又有著密切聯(lián)系,骨內(nèi)細(xì)胞包括成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和骨細(xì)胞。近年來研究表明,骨質(zhì)疏松發(fā)生的骨內(nèi)細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在成骨細(xì)胞,而骨細(xì)胞凋亡發(fā)生率較低。因此,筆者觀察主要集中在骨細(xì)胞凋亡方面。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控,在哺乳動(dòng)物中bcl-2基因及其相關(guān)蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起重要作用,可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性,抑制細(xì)胞凋亡,是一種凋亡抑制基因,有人稱之為長壽基因。3.1骨細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)本研究標(biāo)本均為股骨頸骨折后30d以內(nèi),組織學(xué)觀察有不同程度的空骨陷窩形成,意味著出現(xiàn)了骨細(xì)胞的死亡,并隨著時(shí)間的發(fā)展而加重。在不同組中均可見到凋亡的骨細(xì)胞,其特征是核固縮,染色質(zhì)深染濃集,核碎裂,形成凋亡小體。Dunstan等發(fā)現(xiàn),部分骨細(xì)胞在骨陷窩中消失的現(xiàn)象可以增加老年髖部骨折個(gè)體股骨頭內(nèi)骨小梁數(shù)量,推測(cè)可能與骨細(xì)胞凋亡有關(guān)。TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡也表明,中期組細(xì)胞凋亡較晚期組少。隨著骨折后時(shí)間延長,晚期組出現(xiàn)不同程度的修復(fù)。在此過程中既有骨細(xì)胞凋亡所致骨吸收,又有成骨細(xì)胞增生致新骨形成。近年來的研究表明,骨細(xì)胞具有感受并傳遞骨組織應(yīng)力信號(hào)的功能,這種應(yīng)力信號(hào)可以通過骨細(xì)胞傳遞給破骨細(xì)胞,使破骨細(xì)胞將不再接受應(yīng)力部位的骨細(xì)胞清除,骨細(xì)胞中的一部分是經(jīng)歷凋亡后被破骨細(xì)胞吞噬清除的。另外,骨細(xì)胞還可以傳遞骨損傷表面的信號(hào),使破骨細(xì)胞清除損傷骨細(xì)胞。而骨內(nèi)骨細(xì)胞的死亡或凋亡可以產(chǎn)生針對(duì)破骨細(xì)胞的傳遞信號(hào),使破骨細(xì)胞清除損傷區(qū)域的骨組織,否則作為骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞聯(lián)系信號(hào)中斷的結(jié)果,將導(dǎo)致骨壞死區(qū)域累積,增加骨折危險(xiǎn)性。3.2骨細(xì)胞增殖和凋亡細(xì)胞凋亡的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑都有一個(gè)共同的通路或交匯點(diǎn),而該共同通路或交匯點(diǎn)受Bcl-2調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)表明,Bcl-2可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)大多數(shù)DNA損傷因子的抵抗性,抑制細(xì)胞凋亡,但其本身并不能抑制這些因素對(duì)細(xì)胞的損傷,同樣也不能促進(jìn)DNA修復(fù)。Bcl-2基因在各種正常細(xì)胞的激發(fā)和發(fā)育過程中可以有表達(dá),而在成熟的或走向凋亡的細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。Bcl-2免疫組化染色表明,早期組及晚期組表達(dá)均較中期組弱,差異有顯著性意義(P<0.05)。其可能機(jī)制是在早期組由于股骨頸骨折導(dǎo)致血供受阻而引起大量骨細(xì)胞缺血壞死及凋亡;中期組由于血供的部分恢復(fù),形成類似缺血再灌注損傷,產(chǎn)生大量的氧自由基和過氧化物,從而通過分子途徑激活Bcl-2基因表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡。骨組織作為一種不斷重建的組織,其數(shù)量很大程度上取決于構(gòu)成該組織的活性細(xì)胞數(shù)量。構(gòu)成骨組織的細(xì)胞主要包括骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞等,其中骨細(xì)胞的數(shù)量及活性對(duì)于骨量的維持起著重要作用。骨細(xì)胞的確切作用目前還不十分清楚,有證據(jù)顯示,骨細(xì)胞能對(duì)機(jī)械載荷的刺激產(chǎn)生反應(yīng),推測(cè)骨細(xì)胞可能是骨基質(zhì)中的應(yīng)力刺激受體傳感器,感應(yīng)骨組織上的載荷大小和方向變化,并把信息傳導(dǎo)到骨形成和吸收相關(guān)的細(xì)胞,引起骨結(jié)構(gòu)的再建和修復(fù)。Noble等研究發(fā)現(xiàn),成人病理性骨組織和嬰兒顱骨中有大量骨細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞凋亡,而在成人正常皮質(zhì)骨中,凋亡的細(xì)胞很少發(fā)現(xiàn),骨細(xì)胞的出現(xiàn)可以抑制破骨細(xì)胞的破骨功能,與骨轉(zhuǎn)換有明顯關(guān)系。因此,他們認(rèn)為,病理骨組織較高的轉(zhuǎn)換率可以引發(fā)骨細(xì)胞的快速凋亡。司曉輝等認(rèn)為,骨折愈合時(shí)細(xì)胞增殖和凋亡同時(shí)發(fā)生,在骨折愈合的膜內(nèi)成骨期,此時(shí)骨折端附近的細(xì)胞處于去分化狀態(tài),增殖明顯。在細(xì)胞去分化達(dá)到高峰期時(shí),細(xì)胞凋亡也達(dá)到最多,而在細(xì)胞分化和成熟期時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)量也減少。這說明細(xì)胞增殖和凋亡這兩個(gè)過程是協(xié)調(diào)發(fā)展的。在高轉(zhuǎn)換率骨組織中,骨細(xì)胞被破骨細(xì)胞清除,所以,骨細(xì)胞凋亡與骨組織生長、代謝和