第五章 目的基因的獲取

第五章目的基因的獲取把需要研究的基因稱為目的基因（靶基因或者插入基因）。要分離、改造、擴(kuò)增或表達(dá)的基因。

目的基因：如：生長(zhǎng)激素基因、干擾素基因等。就是幾千個(gè)或幾百個(gè)甚至更少的堿基對(duì)的DNA片段。生物種類人擬南芥果蠅水稻蠕蟲流感病毒基因數(shù)目（萬(wàn)個(gè)）3~42.551.3651.780.175單個(gè)gene在整個(gè)基因組中所占的比例極其微小，加上復(fù)雜的基因間序列；對(duì)單個(gè)目的gene的分離如同大海撈針。已知基因的獲取方法：⒈PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因⒉化學(xué)方法人工合成目的基因未知基因的獲得途徑：⒈構(gòu)建基因組文庫(kù)利用鳥槍法克隆目的基因2.構(gòu)建cDNA文庫(kù)，篩選目的基因3.mRNA差異顯示技術(shù)篩選差異表達(dá)基因4.酵母雙雜交體內(nèi)鑒定基因本章內(nèi)容第一節(jié)基因組DNA的片斷化

第二節(jié)基因的化學(xué)合成第三節(jié)目的基因的保存和擴(kuò)增第四節(jié)目的基因的分離和擴(kuò)增

第一節(jié)基因組DNA的片斷化二、限制性內(nèi)切酶消化法一、

機(jī)械切割法一.機(jī)械切割法（1）超聲波斷裂成約300bp的隨機(jī)片斷（2）高速攪拌1500轉(zhuǎn)/分下攪拌30min，可產(chǎn)生約8kb的隨機(jī)片斷（3）移液器抽吸法二、限制性內(nèi)切酶消化法用限制性內(nèi)切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切基因組DNA1.優(yōu)點(diǎn)

如果帶有粘性末端，產(chǎn)物可以直接與載體連接，連接效率高2.缺點(diǎn)①目的基因內(nèi)部可能有內(nèi)切酶的切點(diǎn)BamHIBamHIBamHIGene目的基因也被切成碎片！②消化的片斷分子量太大或太小不符合載體容量，不能克隆解決的辦法采用隨機(jī)片斷化制備DNA的克隆片斷3.限制性內(nèi)切酶局部消化法控制內(nèi)切酶的用量和消化時(shí)間，使基因組中的酶切位點(diǎn)只有一部分被隨機(jī)切開。①內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的堿基數(shù)影響所切出的產(chǎn)物的長(zhǎng)度和隨機(jī)程度限制性內(nèi)切酶的選用原則1）4bp的內(nèi)切酶平均每4096（46）bp一個(gè)切點(diǎn)。2）6bp的內(nèi)切酶平均每256（44）bp一個(gè)切點(diǎn)隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、MobI、Sau3AI②內(nèi)切酶粘性末端能與常用克隆位點(diǎn)相連Sau3AIBamHI5’-GATC-3’5’-GGATC-3’文庫(kù)：是指一種全體的集合。通過克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的某種生物、組織、器官或細(xì)胞類型的所有DNA片段而構(gòu)成的克隆集合體。

克隆并不是為了保存，而是為了分離。

第三節(jié)目的基因的保存和擴(kuò)增一、基因文庫(kù)（genelibrary）1.基因文庫(kù)為什么要建基因文庫(kù)？高等生物的基因組DNA十分復(fù)雜，單個(gè)基因在基因組或某個(gè)特定發(fā)育階段或特定組織中所占比例很小。因此，要想從龐大的基因組中分離某個(gè)特定的未知基因非常難的，必須構(gòu)建基因文庫(kù)，利用文庫(kù)篩選技術(shù)獲得該基因的陽(yáng)性克隆，然后對(duì)其進(jìn)行分析?；蛭膸?kù)的分類基因組文庫(kù)：提取染色體基因組DNA。如果要研究的是控制基因表達(dá)的調(diào)控序列，或是在mRNA中不存在的某種特定序列。cDNA文庫(kù)：mRNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA。如果研究的目標(biāo)是弄清一種蛋白質(zhì)的氨基酸序列，可以根據(jù)克隆的cDNA分子的核苷酸序列推導(dǎo)出來。mRNA結(jié)構(gòu)圖DNA結(jié)構(gòu)圖2.基因文庫(kù)的構(gòu)建載體的制備DNA的提取及片段化、cDNA的合成載體與插入片段的連接

重組DNA分子導(dǎo)入宿主菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選將某種生物細(xì)胞的整個(gè)基因組DNA切割成大小合適的片斷，并將所有這些片斷都與適當(dāng)?shù)妮d體連接，引入相應(yīng)的宿主細(xì)胞中繁殖保存和擴(kuò)增。二、基因組文庫(kù)的構(gòu)建1.基因組文庫(kù)理論上講，這些重組載體上帶有了該生物體的全部基因篩選目的基因目前常用的載體2.載體選用載體能夠容載的DNA片斷大小直接影響到構(gòu)建完整的基因文庫(kù)所需要的重組子的數(shù)目。載體容量越大，所要求的DNA片斷數(shù)目越少對(duì)載體的要求載體系列：容量為24kpcosmid載體：容量為50kbYAC：容量為1MbBAC:容量為300kb（1）λ噬菌體載體最常用

插入型載體構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，通常用限制性核酸內(nèi)切酶切割位于λ噬菌體DNA非必需區(qū)的單一酶切位點(diǎn)，以供外源基因片段的插入，插入片段適宜長(zhǎng)度約為9kb。

替代型載體構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，需要將非必需區(qū)兩邊的臂進(jìn)行分析純化，才能用于連接，插入片段適宜長(zhǎng)度約為9～22kb。（2）黏粒載體不僅能克隆和增殖完整的真核基因，還可克隆和分析組成某一基因家族或基因座的真核DNA片段。構(gòu)建過程與噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建過程相似。（3）YAC、BAC載體克隆大片斷DNA的載體?？捎脕砜寺⊥暾膭?dòng)物基因。在人類基因組計(jì)劃中，YAC被廣泛地用于大規(guī)?；蚪M結(jié)構(gòu)分析。最早用于基因克隆的載體。只能容納比質(zhì)粒分子量更小的片段。不能用于核基因組文庫(kù)。適合于短序列的克隆文庫(kù)。葉綠體DNA文庫(kù)、線粒體DNA文庫(kù)、cDNA文庫(kù)。（4）質(zhì)粒載體3.基因組文庫(kù)構(gòu)建的一般步驟（1）基因組DNA的提取關(guān)鍵:制備高分子質(zhì)量的基因組DNA經(jīng)典的方法：在EDTA和SDS存在下，用蛋白酶K消化細(xì)胞，然后用酚－氯仿混合液抽提蛋白質(zhì)，并用透析法去除分子質(zhì)量雜質(zhì)。在提取時(shí)必須盡可能地避免機(jī)械切割關(guān)鍵：斷點(diǎn)完全隨機(jī)，片斷長(zhǎng)度合適于載體連接（2）DNA克隆片段的制備超聲波（300bp）或機(jī)械攪拌（8kb）①物理切割法：內(nèi)切酶Sau3A進(jìn)行局部消化?？傻玫?0-30kb的隨機(jī)片斷②酶切法：（3）載體與基因組DNA大片段的連接①粘性末端直接連接載體與外源DNA大片段的兩個(gè)末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A與BamHI的酶切末端。直接連接、人工接頭或同聚物加尾②人工接頭法人工合成的限制性內(nèi)切酶粘性末端片斷各種酶的接頭可以向公司定做或購(gòu)買接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉(zhuǎn)移酶粘性末端③同聚物加尾4.基因組文庫(kù)的大小一個(gè)文庫(kù)要包含99%的基因組DNA時(shí)所需要的克隆數(shù)目N=ln(1-p)ln(1-f)p:文庫(kù)包含了整個(gè)基因組DNA的概率（99%）f:插入載體的DNA片斷的平均長(zhǎng)度占整個(gè)基因組DNA的百分?jǐn)?shù)N:所需的重組載體數(shù)（克隆數(shù)）基因文庫(kù)的大小以及從中獲得特定序列的概率的計(jì)算公式：例如：人的基因組是3×109bp，插入DNA片斷的平均長(zhǎng)度如果是1.7×104bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG:Genome大?。籪:fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104=8.1×1055.基因組文庫(kù)的擴(kuò)增及保存（1）基因組文庫(kù)的擴(kuò)增①液體培養(yǎng)增殖法最簡(jiǎn)便混合培養(yǎng)方法：從瓊脂糖平板上挑取已長(zhǎng)出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長(zhǎng)數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-80℃儲(chǔ)存（加終濃度為25%的甘油）缺點(diǎn)：由于細(xì)菌在液體中以混合群體的形式生長(zhǎng)和不同克隆生長(zhǎng)速率的差異，導(dǎo)致文庫(kù)中某些特定的序列過多或過少。保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長(zhǎng)到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-80℃保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大。384孔板②影印濾膜培養(yǎng)法失真最小，最麻煩用包裝后的噬菌體顆粒感染細(xì)菌，并讓細(xì)菌在硝酸纖維素膜上生長(zhǎng)，然后將濾膜上的文庫(kù)影印到其他濾膜上，以供篩選和低溫（-80℃）保存。③制備已包裝的轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物適用于粘粒文庫(kù)，轉(zhuǎn)導(dǎo)性裂解物可以在低溫下長(zhǎng)期保存。（2）基因組文庫(kù)的保存小包裝，方便，避免反復(fù)凍融噬菌體一類的基因文庫(kù)：密封，加入少許氯仿，在4℃冰箱內(nèi)可較長(zhǎng)時(shí)間地保存（6個(gè)月），低溫冰箱可保存數(shù)年。500kb50-300kb100-300kb，濃縮產(chǎn)物濃度達(dá)到100ng/ul三、cDNA文庫(kù)的構(gòu)建cDNA文庫(kù)：是指某種生物體某一發(fā)育時(shí)期所轉(zhuǎn)錄的全部的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。cDNA文庫(kù)具有組織細(xì)胞特異性，具有時(shí)效性。為什么要構(gòu)建cDNA文庫(kù)？真核生物的基因組DNA龐大且含有大量的重復(fù)序列，難以分離到目的基因片段。1.cDNA以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出的DNA稱cDNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉(zhuǎn)錄酶引物2.cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)（1）不含內(nèi)含子序列（2）可以在細(xì)菌中直接表達(dá)（3）包含了所有編碼蛋白質(zhì)的基因（時(shí)效性）（4）比基因組DNA文庫(kù)小得多，容易構(gòu)建3.構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般步驟（1）mRNA的來源特點(diǎn)：多數(shù)基因的表達(dá)具有不同程度的組織特異性和發(fā)育階段性。

選用mRNA含量高的組織材料，或通過藥物等方法提高mRNA的含量。高豐度：當(dāng)特定的mRNA在細(xì)胞總mRNA群體中所占比例達(dá)到50～90％時(shí)。低豐度：當(dāng)上述比例小于0.5％時(shí)。分離mRNA用商業(yè)化的OligodT纖維柱。利用真核生物mRNA都含有一段30～300個(gè)A組成的polyA尾巴，將mRNA從總RNA（rRNA、tRNA等）中分離純化。mRNA只占總RNA的1%-5%。（2）mRNA的分離純化①原理②mRNA的分離純化纖維素柱層析法③mRNA的長(zhǎng)度哺乳動(dòng)物mRNA長(zhǎng)度為500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb。反轉(zhuǎn)錄酶（3）cDNA的合成①cDNA第一鏈合成逆轉(zhuǎn)錄酶能以RNA為模板合成DNA。a.OligodT引導(dǎo)合成法從3’-開始，無(wú)法到達(dá)5’-末端mRNAcDNA3’5’5’AAAAAAATTTTTTTOligodT引物RNA－D