幾種常用抗原的制備方法

幾種常用抗原的制備一、脂多糖抗原制備（一） 粗制LPS制備，參見第六章（二） 精制LPS制備1、 粗制LPS經(jīng)3倍95%酒精，37°C水浴作用15分鐘；離心后，沉淀物以蒸餾水配成3%溶液。2、 超速離心100000Xg4小時。上層為上清液，中間層為沉淀的LPS膠體，下層為粘液樣沉淀物。3、 吸棄上清，小心取出沉淀物的LPS膠體（中間層）。4、 將LPS溶解在原體積的1/2蒸餾水中，再離心一次。5、 沉淀的LPS溶液于少量DW中，凍干保存。超離后分層情況（三） 多糖抗原制備：1、 將LPS200mg溶解在20ml1%醋酸溶液中，以移入帶塞的試管中。2、 100C水浴30分鐘。3、 5000Xg離心沉淀類脂，吸取上部液體，裝入透析袋中，4C透析48小時。4、 凍干提取的多糖，產(chǎn)量為LPS的30——、40%。成功范例：沙門氏菌A—F群LPS提取。二沙門氏菌鞭毛抗原的制備1、將半固體培養(yǎng)基篩選活潑動力的單相沙門氏菌血清型接種到10mlM肉湯中，37°C16小時。2、 再移種到500mlM肉湯中，37C16小時。3、 400ur/m離心30分鐘，收集細(xì)菌。4、 以適量生理鹽水懸浮菌泥，并用1N鹽酸調(diào)至PH7.0,室溫輕度振蕩30分鐘.5、 1000r/m30分鐘.上清中含有大量脫落下來的鞭毛素.6、 以1NnaOH將上清調(diào)至PH7.2.緩慢加入飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，達(dá)67%飽和硫酸銨濃度后,4C過夜.8次日將上清以15000r/m4C離心20分鐘。9、 將沉淀物溶解于2ml蒸餾水中。10、過SephacrylS300層析柱（2.0X50cm），用Tris—HCL緩沖液洗脫，流速20ml/小時，收集第一峰，測定蛋白質(zhì)濃度，分裝保存。若對提純要求不高，可以省略此步。11、 提純鞭毛素的質(zhì)量鑒定（1） SDS—PAGE：在非降解和降解條件下于10%凝膠SDS——PAGE垂直板上電泳（KB—2301電泳儀），恒流，25Ma/板，10C電泳5小時。（2） 凝膠用三氯醋酸溶液固定過夜色。用考馬斯亮蘭G—250染色。（3） 計算蛋白帶分子量：Ha50000，Hb53000，Hd46000。12提純鞭毛素的等電點測定一IEF取60ul樣品溶解在9M脲和1%2—巰基乙醇中。上樣于含有2%Ampholin(PH3.5—9.5)(LKBBromma，Sweden)和6M脲的4%聚丙烯酰胺凝膠(用22.2%聚丙烯酰胺和1.4%雙甲丙叉烯酰胺原液配制)。蛋白質(zhì)在LKB1117—003多功能電泳儀上，恒流4mA待電聚焦至電壓250—300V。電泳5小時后，用10%三氯醋酸固定凝膠，經(jīng)40%乙醇洗滌后，用0.1%考馬斯亮蘭G250染色過夜，再用14%醋酸脫色.確定PH梯度凝膠，從陽極端切成0.5cm長度，分別裝入小試管內(nèi)，加去離子水1小時后，用酸度計或PH試紙測PH值，劃出PH梯度斜線,并確定樣品的等電點?(Ha5.1,Hb5.1Hd4.9)。三、 粘附素抗原的制備(一) K88、K99和K987p的制備1、 將G—7或E68、C83907和UP001在37°C培養(yǎng)16—20小時。2、 從克氏瓶中洗下，用0.1MPBS(PH7.0)懸浮。3、 62C水浴振蕩20分鐘使粘附素脫落。4、 8000r/m20分鐘，其上清液用10%乙酸調(diào)PH至4.5,4C放置過夜，使K88粘附素沉淀(等電點沉淀)。5、 以8000r/m離心，將沉淀物用0.1MPBS溶解。6、 經(jīng)SephadexG200柱層析(2.6X80cm)純化，用0.01MPBS(PH7.0)作為平衡液及洗脫液，流速為1ml/分.7、 收集第1峰,合并前半峰即為純化K88抗原?。8、 測定蛋白質(zhì)濃度，小量分裝，一30°C保存?zhèn)溆?。（二?K99抗原的制備1、 K994529在Minca培養(yǎng)基上37C培養(yǎng)18小時。2、 磷酸鹽尿素緩沖液洗下菌細(xì)胞。3、 60C加熱孵化20分鐘，離心后去菌體,上清加60%飽和硫銨，4C攪拌2小時。4、 離心收集沉淀，懸浮沉淀對上述緩沖液透析16小時。5、 進(jìn)一步經(jīng)SephadexCL—4B柱層析純化，濃縮后再經(jīng)SephadexG—50脫鹽。（三） 987P抗原的制備1、 C88710Slane培養(yǎng)基37C20小時培養(yǎng)。2、 生理鹽水洗下菌笞，離心收集菌體。3、 菌泥中加入400ml含2M尿素0.01MPBS,60——63C1—1.2小時。4、 60%飽和度硫酸銨沉淀離心上清。5、 離心后，沉淀物再過Sepharose4B柱。6、 收集第一峰前半峰，濃縮后經(jīng)SephadexG50脫鹽。（四） F48抗原的制備1、 C95707、C85919和B41M分別接種Minca培養(yǎng)基上，37C18小時。

2、 滅菌0.05MPH7.2PB收集菌體。3、 62°C水浴加熱處理1小時，并不時振動，離心去菌體。4、 上清置4C72小時，等電點4.6沉淀法使粘附素沉淀?5、 離心后，將沉淀于SeparoseCL—4B純化，以含2M尿素0.05MPH7.2PBS洗脫，洗脫液濃縮后再脫鹽。附：各種粘附素等電點。TOC\o"1-5"\h\zK88 4.2K99 9.7987P 3.7F41 4.6四、 全菌抗原的制備1、 丙酮滅活菌制備參見前述。2、甲醛滅活全菌制備：以0.4—0。6%甲醛生理鹽水與新鮮肉湯培養(yǎng)物等體積混滅菌，經(jīng)PBS洗滌后，配成1—10X10（6）/ml,4C保存?zhèn)溆谩?、 熱滅活全菌制備：將鮮培養(yǎng)物以DW稀釋至10億/ml細(xì)菌，100C水浴2小時，離心吸取上清（另一種抗菌原），菌泥進(jìn)一步用PBS洗3次，保存?zhèn)溆谩?、 酒精滅洗全菌制備。五、 病毒抗原的制備（一）雞新城疫病毒提純—“層析法”1、1、雞紅細(xì)胞吸附釋放法。雞紅細(xì)胞吸附表面有一種糖蛋白受體，在4°C時，病毒被吸附到紅細(xì)胞膜的受體上，但在37C時病毒的N—乙酰神經(jīng)氨酶破壞受體的糖苷鍵后，病毒又可以從紅細(xì)胞膜上釋放。操作步驟如下：感染病毒的雞胚囊液，在4C下6000r/m,30分鐘，棄沉淀。上清液根據(jù)病毒血凝滴度的高低，加入1—3%的新鮮洗滌的雞紅細(xì)胞，在4C下吸附1—2小時。3000r/m0分鐘，棄去上清。吸附有病毒的紅細(xì)胞重懸浮于1X鈣鹽水中(含4%CaCL2的生理鹽水)，在37C下放置2—4小時。(5) 3000r/m20分鐘取上清。28000r/m小時，沉淀重懸于小容積的生理鹽水中，即為初步純化病毒。2、 解脫后的病毒蛋白液再上SepadexG—200柱，以PBS洗脫,收集第1峰。即為進(jìn)一步純化的NDV。(二)NDV純化—離心法1、 NDV種毒以滅菌生理鹽水作1：100稀釋，再接9—11日齡SPF雞胚的絨毛尿囊腔內(nèi)(0.1—0.2ml/胚)。2、 37C孵化，每天照蛋兩次，收獲24—96小時死亡雞胚的澄清無菌之尿囊液，測血凝價，分裝一30C保存?zhèn)溆谩?、 尿囊液經(jīng)5000Xg30分鐘。4、 取上清102732Xg離心30分鐘。5、再取上清用20%蔗糖墊底，110000Xg離心2.5小時5、6、 取沉淀用少量PBS懸浮，經(jīng)10—60%蔗糖等到密度性梯度離心，91000Xg 16小時（BecKman，L7，SW28）。7、 收集含病毒的蔗糖區(qū)帶。8、 用PBS稀釋上清，110000Xg離心2.5小時。用小量PBS懸浮沉降病毒，小量分裝，一70°C保存?zhèn)溆谩＃ㄈ㎞DVHNNPF蛋白制備一SDS—PAGE。附：聚乙二醇法濃縮病毒在病毒懸液中加入一定量的PEG6000。在此條件下，病毒可隨其他大分子物質(zhì)發(fā)生沉淀。操作步驟如下：（1） 收獲經(jīng)病毒感染的尿囊液，6000r/m30分鐘，棄沉淀。（2） 上清液中加入7.5%的PEG和0.1—00.4MnaCL，4C下放置2—4小時。（3） 6000r/m30分鐘，收集絮狀沉淀物，重懸于小容量的緩沖液內(nèi)。六、 MDV羽囊瓊擴(kuò)抗原制備，從略。七、 IBDV瓊擴(kuò)抗原制備，從略。八、 轉(zhuǎn)鐵蛋白制備：利凡諾—低溫乙醇分級沉淀法。1000ml血漿加與血漿等到體積的2.0%利凡諾（內(nèi)含1%Na2CO370ml），邊加邊攪拌產(chǎn)生黃色粘性沉淀物（為白蛋白）校正上清PH8.1—8.2，靜置3—4小時白蛋白沉淀）棄收集上清液加1%活性吸附利凡諾（20分鐘）抽濾，得澄清濾液移入一10°C冷凍用1MHac調(diào)PH7.0—7.2加乙醇終濃度為25%（乙醇要用Hac調(diào)PH7.0—7.2）校正PH7.0—7.2—60—70C放2小時—4C離心20分鐘（20000r/m）球蛋白沉淀）棄上清冷至一8C（調(diào)PH5.80+（-）0.05）加乙醇至終濃度40%調(diào)PH5.8+（—）0.05—10C放置沉淀過夜—4C離心，收微紅色沉淀（轉(zhuǎn)鐵蛋白）沉淀溶于5—10倍無熱