第四章 病毒抗原與抗體檢測技術(shù)

第四章

病毒抗原與抗體檢測技術(shù)預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心柏樺一、抗原—抗體反應(yīng)特異性高可逆氫鍵、范德華力、靜電吸引力可見抗原-抗體比例適宜，復(fù)合物相成團(tuán)二、影響反應(yīng)的因素電解質(zhì)pH≥7時(shí)，適當(dāng)電解質(zhì)使其結(jié)合可見凝集團(tuán)或沉淀溫度37℃溫度升高，反應(yīng)加快<56℃酸堿度pH6~8接近等電點(diǎn)時(shí)易出現(xiàn)假陽性第一節(jié)免疫熒光技術(shù)ImmunofluorescenceassayIFA能解決：是什么在哪里有多少熒光激發(fā)光譜發(fā)射光譜熒光效率熒光壽命熒光猝滅熒光偏振第一節(jié)免疫熒光技術(shù)熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)最大吸收光譜最大發(fā)射光譜應(yīng)用異硫氰酸熒光素(FITC)490～495nm520～530nm（黃綠色）FAT、熒光偏振免疫測定四乙基羅丹明(RB200)570～575nm595～600nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)550nm620nm（橙紅色）FITC的襯比染色或雙標(biāo)記FAT藻紅蛋白（PE）490-560nm595nm（紅色）雙標(biāo)記FAT、流式細(xì)胞術(shù)7-氨基-4-甲基香豆素354nm430nm（藍(lán)色）雙標(biāo)記或多標(biāo)記FATEu3+螯合物340nm613nm時(shí)間分辨熒光免疫測定二、免疫熒光試驗(yàn)（一）原理用熒光標(biāo)記物標(biāo)記病毒抗原或抗體，作為分子探針，檢查細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的病毒抗體或抗原。熒光標(biāo)記物受激發(fā)光照射后發(fā)光，用熒光顯微鏡觀察，可確定病毒種類、定位、定量。二、免疫熒光試驗(yàn)（二）類型熒光抗體法熒光抗原法免疫細(xì)胞（組織）化學(xué)技術(shù)二、免疫熒光試驗(yàn)（三）方法制備標(biāo)本制備熒光抗體熒光抗體染色熒光顯微鏡檢查二、免疫熒光試驗(yàn)1.制作病毒染色標(biāo)本培養(yǎng)敏感細(xì)胞（細(xì)胞爬片）↓種毒

↓固定、干燥丙酮二、免疫熒光試驗(yàn)1.制作病毒染色標(biāo)本臨床樣本（非固型組織）↓涂片↓固定、干燥二、免疫熒光試驗(yàn)1.制作病毒染色標(biāo)本尸檢樣品（3~5mm）

↓↓↓脫水脫色冰凍切片印片↓↓石蠟固定、脫蠟丙酮固定、干燥二、免疫熒光試驗(yàn)2.熒光抗體制備制備抗體用高純度病毒免疫動物獲取血清，分離IgG，提純

家兔、綿羊、山羊高特異性高親和力二、免疫熒光試驗(yàn)2.熒光抗體制備標(biāo)記熒光素共價(jià)鍵結(jié)合抗體+熒光素↓4℃持續(xù)攪拌數(shù)小時(shí)純化（離心、透析、過濾）二、免疫熒光試驗(yàn)3.鑒定制成的熒光抗體以FITC為例熒光（F）蛋白（P）結(jié)合率調(diào)整制備液至A280mm=12.87×A495mm

A280mm-0.35×A495mm比值越大，抗體結(jié)合熒光素越多F/P=二、免疫熒光試驗(yàn)3.鑒定制成的熒光抗體測定抗體效價(jià)：雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)抗體特異性：吸收試驗(yàn)、抑制試驗(yàn)抗體特異性染色滴度：倍比稀釋二、免疫熒光試驗(yàn)4.熒光抗體染色直接法二、免疫熒光試驗(yàn)4.熒光抗體染色間接法二、免疫熒光試驗(yàn)4.熒光抗體染色補(bǔ)體法熒光標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體雙標(biāo)記法兩種熒光素抗體檢測兩種抗原二、免疫熒光試驗(yàn)5.設(shè)立對照區(qū)分特異性和非特異性染色標(biāo)本自發(fā)熒光對照熒光抗體對照陽性抗原對照阻斷試驗(yàn)三、免疫熒光顯微鏡技術(shù)熒光顯微鏡利用一定波長的激發(fā)光對樣品進(jìn)行激發(fā)，產(chǎn)生一定波長的熒光，對樣品結(jié)構(gòu)或其組分進(jìn)行定性、定位、定量觀察檢測。

三、免疫熒光顯微鏡技術(shù)光源：高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)魹V光片：隔熱、激發(fā)和吸收濾光片光路：透射光、落射光聚光器：明視野、暗視野和相差熒光聚光器鏡頭：消色差鏡頭三、免疫熒光顯微鏡技術(shù)透射光：照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光：照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本，經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。四、時(shí)間分辯免疫熒光技術(shù)Time-resolvedfluoroimmunoassayTR-FIA（一）原理自發(fā)熒光壽命短:1ns～10ns鑭系元素壽命長:10μs～1000μs短壽命熒光完全衰變后再測定鑭系元素特異熒光銪Ed3+锝Tb3+釤Sm3+鏑Dy3+四、時(shí)間分辯免疫熒光技術(shù)（二）方法類型雙抗體夾心法固相抗體和Eu3+標(biāo)記抗體與待檢抗原結(jié)合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標(biāo)記抗體復(fù)合物，酸性增強(qiáng)液下，Eu3+解離，340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。四、時(shí)間分辯免疫熒光技術(shù)（二）方法類型固相抗體競爭法待檢抗原和Eu3+標(biāo)記抗原與固相抗體競爭結(jié)合,溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。固相抗原競爭法待檢抗原和固相抗原競爭結(jié)合定量的Eu3+標(biāo)記抗體，溫育洗滌后在固相中加入熒光增強(qiáng)液,測定熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度與待檢抗原含量成反比。第二節(jié)酶免疫技術(shù)Enzymeimmunoassay抗原抗體反應(yīng)特異性酶高效催化反應(yīng)專一性

第二節(jié)酶免疫技術(shù)酶底物顯色反應(yīng)

測定波長

辣根過氧化物酶HRP

鄰苯二胺OPD

四甲替聯(lián)苯胺TMB

氨基水楊酸

鄰聯(lián)苯甲胺

2,2‘-連胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)銨鹽橘紅色

黃色

棕色

蘭色藍(lán)綠色492460449

425

642

堿性磷酸酯酶AP4-硝基酚磷酸鹽(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸鹽+重氮鹽黃色

紅色

400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑蘭黃色

深藍(lán)色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基傘酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)熒光

黃色

360,450

420第二節(jié)酶免疫技術(shù)酶標(biāo)記戊二醛交聯(lián)法過碘酸氧化法醛基酶蛋白質(zhì)HRP過碘酸鹽HRP醛基第二節(jié)酶免疫技術(shù)固相載體塑料制品微粒膜載體NC膜、尼龍膜第二節(jié)酶免疫技術(shù)包被與封閉包被適宜濃度蛋白質(zhì)封閉二次包被填補(bǔ)空隙小牛血清二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)Enzyme-linkedimmunosorbentassayELISA酶標(biāo)記抗體（抗原）與待測抗原（抗體）發(fā)生特異性反應(yīng)，加入酶底物，通過酶對底物的顯色反應(yīng)，對待測抗原（抗體）進(jìn)行定位、定性或定量分析。間接法檢測抗體+++固相抗原標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色雙抗體夾心法檢測抗原+++固相抗體標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色競爭法可檢測抗原、抗體YYY+YYY+YYY參考管酶標(biāo)抗原YYY+YYY+YYY待測管酶標(biāo)抗原抗原捕獲法檢測IgM抗體+++抗IgM標(biāo)本抗原酶標(biāo)抗體顯色

（含IgM）+三、免疫酶染色試驗(yàn)ImmunoenzymaticstainingtestIEST酶標(biāo)抗體（抗原）—抗原（抗體）復(fù)合物

底物

有色底物三、免疫酶染色試驗(yàn)細(xì)胞免疫酶染色均相酶免疫測定——無需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物酶標(biāo)記物結(jié)合后改變酶活性非均相酶免疫測定—需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物液相：用二抗或沉淀去除游離酶標(biāo)記物固相：ELISA第三節(jié)放射免疫技術(shù)RadioimmunoassayRIA利用放射性核素靈敏精確性與抗原抗體反應(yīng)特異性相結(jié)合進(jìn)行定量分析放射免疫核素標(biāo)記抗原與未標(biāo)記抗原競爭性結(jié)合特異性抗體免疫放射核素標(biāo)記抗體結(jié)合待測抗原R.S.Yalow第三節(jié)放射免疫技術(shù)125I、131I、3H、14C標(biāo)記純化鑒定放射性免疫活性第三節(jié)放射免疫技術(shù)第三節(jié)放射免疫技術(shù)放射免疫競爭法++++++++BoundFreeAgAb6/8=0.754/8=0.52/8=0.251/8=0.125B/B+F第三節(jié)放射免疫技術(shù)放射免疫以未結(jié)合的Ag*為F，Ag*Ab復(fù)合物為B，則B/F或B/(B＋F)與Ag的量變存在著函數(shù)關(guān)系－劑量反應(yīng)曲線第四節(jié)血清學(xué)試驗(yàn)中和試驗(yàn)血凝/血凝抑制試驗(yàn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)一、中和試驗(yàn)neutralizationtest體外將病毒與特異性抗體混合并發(fā)生反應(yīng)，再將混合物接種至敏感的宿主體內(nèi)，然后測定殘存病毒感染力的方法。

中和抗體一、中和試驗(yàn)（一）原理中和抗體存在使病毒不能吸附和穿入宿主細(xì)胞，使病毒失去感染力。當(dāng)病毒與抗體混合后，接種敏感宿主細(xì)胞再觀察敏感宿主的情況，即觀察殘存的病毒對宿主的感染力。一、中和試驗(yàn)（二）方法步驟病毒---已知滴度，并有感染力測滴度：細(xì)胞培養(yǎng)，將病毒10倍稀釋接種敏感細(xì)胞或動物，觀察CPE或動物感染情況，確定滴定終點(diǎn)以CCID50或LD50表示標(biāo)準(zhǔn)病毒試驗(yàn)濃度：100CCID50/單位體積或100LD50/單位體積一、中和試驗(yàn)抗體用細(xì)胞培養(yǎng)法測病毒抗體的滴度：將倍比稀釋的病毒抗血清液與等量的標(biāo)準(zhǔn)病毒液混合，接種敏感細(xì)胞，觀察CPE。病毒抗體滴度的確定：抗血清保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染的最高稀釋倍數(shù)的倒數(shù)?？贵w滴度的含義：抑制CPE的最高稀釋倍數(shù)的抗血清中，每單位體積含一個(gè)抗體單位。一、中和試驗(yàn)舉例如觀察結(jié)果是1：10至1：320抗血清均能抑制病毒的CPE，也就是當(dāng)抗血清稀釋到320倍時(shí)，0.1ml抗血清含有1個(gè)抗體單位。請問：1：160及1：40含有幾個(gè)抗體單位？標(biāo)準(zhǔn)抗體濃度為20個(gè)抗體單位/0.1ml一、中和試驗(yàn)宿主細(xì)胞培養(yǎng):觀察CPE和空斑（最理想和常用）雞胚：觀察雞胚的死亡（流感）、絨毛尿囊腔上痘瘡及血凝現(xiàn)象（天花、牛痘、HSV）動物（小白鼠）:成年和幼鼠易感，如乙腦病毒、森林腦炎病毒一、中和試驗(yàn)（二）方法步驟固定血清—稀釋抗病毒法檢測病毒及其滴度固定病毒—稀釋抗血清法檢測血清效價(jià)一、中和試驗(yàn)（二）方法步驟固定血清—稀釋病毒法用中和試驗(yàn)方法鑒定病毒時(shí)，將不同稀釋倍數(shù)的病毒與標(biāo)準(zhǔn)的抗血清(20個(gè)抗體單位/單位體積)混合、孵育，使二者充分反應(yīng)，然后將混合液接種到敏感宿主體內(nèi)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。固定血清稀釋病毒法試驗(yàn)材料宿主:敏感細(xì)胞和動物、雞胚標(biāo)準(zhǔn)抗病毒血清(20個(gè)抗體單位/0.1ml)病毒分離物試驗(yàn)步驟不同濃度病毒液與等量的抗病毒血清混合細(xì)胞培養(yǎng)液倍比稀釋病毒不同濃度病毒液與等量陰性血清混合接種細(xì)胞,設(shè)正常細(xì)胞對照，CO2孵箱觀察CPE中和試驗(yàn)病毒CCID50：當(dāng)抗血清組的CCID50與陰性組之差的對數(shù)大于2,才說明中和試驗(yàn)陽性。固定血清稀釋病毒法陰性血清病毒CCID50的計(jì)算病毒稀釋度CPE孔數(shù)/接種孔數(shù)

累計(jì)數(shù)CPE數(shù)存活數(shù)CPE陽性比例CPE陽性率（％）10-45/510010/10100.010-54/5515/683.010-61/5151/617.010-70/50100/10

0固定血清稀釋病毒法距離比例＝（大于50%的CPE陽性率—50%）/（大于50%的CPE陽性率－小于50%的CPE陽性率）＝（83－50）/（83－17）＝0.5lgCCID50=大于50%的CPE陽性率血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)=lg10-5+0.5×lg0.1=-5.5,其反對數(shù)是10-5.5.陰性血清組的病毒CCID50為10-5.5/0.1ml。固定血清稀釋病毒法陽性血清病毒CCID50的計(jì)算病毒稀釋度CP