動(dòng)物干細(xì)胞培養(yǎng)

第十五章動(dòng)物干細(xì)胞技術(shù)

2011.5

主要內(nèi)容

序言干細(xì)胞的定義、分類(lèi)、定位干細(xì)胞的生物學(xué)及形態(tài)學(xué)特征干細(xì)胞的分離純化和培養(yǎng)干細(xì)胞研究意義干細(xì)胞的應(yīng)用前景干細(xì)胞研究中存在的問(wèn)題

序言干細(xì)胞(stemcells,SC)：是一類(lèi)具有無(wú)限增殖和自我修復(fù)能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，也稱(chēng)為“萬(wàn)能細(xì)胞”。

1999年，Science評(píng)價(jià)：世界十大科技進(jìn)展魁首

2000年，Science評(píng)價(jià)：世界十大科技進(jìn)展之一

2002年，Science評(píng)價(jià)：值得關(guān)注的六大科技領(lǐng)域之一

2007年，Science評(píng)價(jià)：IPS(萬(wàn)能細(xì)胞)動(dòng)物干細(xì)胞技術(shù)指通過(guò)各種方法獲得干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)建立細(xì)胞系，并對(duì)其進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)研究，以期獲得需要的某一特定類(lèi)型細(xì)胞。干細(xì)胞研究歷史始于19世紀(jì)，至今已有1個(gè)世紀(jì)。1896年，Wilson在一篇論述細(xì)胞生物學(xué)的文獻(xiàn)中，首次使用“干細(xì)胞”這一概念，專(zhuān)門(mén)用于描述寄生蟲(chóng)生殖系的祖細(xì)胞。1981年，Evans和Kaufman用延遲胚胎著床的方法分離胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，首次成功分離得到小鼠胚胎干細(xì)胞。2007年，科學(xué)家將成年小鼠體細(xì)胞誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)成干細(xì)胞，更加為干細(xì)胞技術(shù)研究提供了新的思路。干細(xì)胞研究意義(1)干細(xì)胞通過(guò)核移植或胚胎嵌合，能得到克隆動(dòng)物，這對(duì)提高優(yōu)良家畜的繁育效率及拯救瀕危動(dòng)物具有重要意義。(2)由于可以對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行體外遺傳操作、選擇和凍存而不失其多能性，所以在特定條件下可誘導(dǎo)分化為人們所需要的細(xì)胞、組織和器官等并用于臨床治療。(3)干細(xì)胞技術(shù)在生物學(xué)基礎(chǔ)研究、農(nóng)業(yè)以及移植醫(yī)學(xué)上具有廣闊的應(yīng)用前景，其研究成果必將引起人類(lèi)臨床醫(yī)學(xué)的一場(chǎng)革命。1、干細(xì)胞的定義、分類(lèi)、定位1.1定義干細(xì)胞(stemcells,SC)：是一類(lèi)具有無(wú)限增殖和自我修復(fù)能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞，存在于個(gè)體的不同階段以及成體的不同組織中。基本特征：自我修復(fù)多向分化潛能干細(xì)胞的分化及自我更新1.2分類(lèi)：1.2.1根據(jù)細(xì)胞分化潛能的大小分為全能干細(xì)胞(totipotentstemcells)三胚層多能干細(xì)胞(pluripotentstemcells)單胚層多能干細(xì)胞(multipotentstemcells)單能干細(xì)胞(monopotentstemcells)全能干細(xì)胞：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞如能發(fā)育成一個(gè)完整的個(gè)體，就稱(chēng)該細(xì)胞的這種潛能為全能性。三胚層多能干細(xì)胞

：指細(xì)胞失去了發(fā)育成完整個(gè)體的能力，但仍具有分化成個(gè)體中各種細(xì)胞的潛能。單胚層多能干細(xì)胞：只能分化成幾種特定類(lèi)型的細(xì)胞，如間充質(zhì)干細(xì)胞通常只能分化成骨、肌肉、軟骨、脂肪及其他結(jié)締組織，而不能分化為除此之外的其他組織。單能干細(xì)胞：只能分化為一種細(xì)胞，如成體干細(xì)胞中的神經(jīng)干細(xì)胞，只能分化為神經(jīng)元，而不能分化為顯形膠原或少突膠原，這種細(xì)胞稱(chēng)為單能干細(xì)胞。人受精卵著床前胚胎發(fā)育過(guò)程

小鼠精卵著床前胚胎發(fā)育過(guò)程桑葚胚（全能干細(xì)胞）1.2.2根據(jù)細(xì)胞來(lái)源不同分為胚胎性干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES細(xì)胞)成體干細(xì)胞(adultstemcells)

（1）胚胎性干細(xì)胞

ES細(xì)胞：指源于囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(innercellmass，ICM)的胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells,ES)。

EC細(xì)胞：從畸胎瘤中分離得到的多能性細(xì)胞(embryoniccarcinormacells，EC)。

EG細(xì)胞：胚胎生殖細(xì)胞，從早期胎兒原始生殖細(xì)胞(primordialgermcells，PGCs)中分離到的細(xì)胞(embryonicgermcells,EG）。均屬三胚層干細(xì)胞。

胚泡（三胚層多能干細(xì)胞）從ICM分離和培養(yǎng)后得到典型的小鼠胚胎干細(xì)胞集落（箭頭所示），周?chē)稚⒂猩掀蛹?xì)胞。標(biāo)尺長(zhǎng)度=200μm,（引自KursadTurksen《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd）,2006）ES細(xì)胞Embryonicstemcell（2）成體干細(xì)胞

定義：成體干細(xì)胞是指一些具有組織特異性的細(xì)胞，它們主要用于維持細(xì)胞功能的穩(wěn)定，具有修復(fù)和再生能力，能夠產(chǎn)生新的干細(xì)胞，或者能按一定的程序分化，形成新的功能細(xì)胞，使組織和器官保持生長(zhǎng)和衰退的動(dòng)態(tài)平衡。

成體干細(xì)胞分類(lèi)：造血干細(xì)胞：存在于骨髓、外周血和臍帶血中，用于治療血液系統(tǒng)疾病以及多種實(shí)體腫瘤。神經(jīng)干細(xì)胞：存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)一步分化成中樞神經(jīng)系統(tǒng)的某些細(xì)胞類(lèi)型。間充質(zhì)干細(xì)胞：存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，由于它具有向骨、軟骨、脂肪、肌肉及肌腱等組織分化的潛能，因而利用它進(jìn)行組織工程學(xué)研究。表皮干細(xì)胞：位于表皮基底層，具強(qiáng)大的增殖分化潛能，在體外可以分化成表皮全層細(xì)胞。表皮干細(xì)胞作為組織工程皮膚的種子細(xì)胞，已經(jīng)在治療燒傷方面發(fā)揮作用。外周血（peripheralblood）是除骨髓之外的血液。臨床上常用一些方法，把骨髓中的造血干細(xì)胞釋放到血液中，再?gòu)难褐刑崛》蛛x得到造血干細(xì)胞，我們把這樣得到的干細(xì)胞稱(chēng)為外周血干細(xì)胞。正常人外周血中只存在有極少量（0.01%）的造血干細(xì)胞?？衫眉?xì)胞分離技術(shù)(血細(xì)胞自動(dòng)分離機(jī))，將外周血中含有造血干細(xì)胞的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行分離保存，重復(fù)數(shù)次達(dá)一定細(xì)胞數(shù)量后，回輸給患者，以之代替骨髓而進(jìn)行干細(xì)胞移植，稱(chēng)為外周血干細(xì)胞移植。

外周血祖細(xì)胞（progenitororprecursorcell）前體細(xì)胞,發(fā)育中通過(guò)一系列分裂，能產(chǎn)生不同細(xì)胞譜系的細(xì)胞。祖細(xì)胞的分化更具明確性，只能分化為一些目標(biāo)細(xì)胞。干細(xì)胞可以無(wú)限增值，而祖細(xì)胞分裂的次數(shù)是有限的，它只能分裂并產(chǎn)生某種類(lèi)型的細(xì)胞。祖細(xì)胞與干細(xì)胞的特點(diǎn)干細(xì)胞的分類(lèi)根據(jù)細(xì)胞分化潛能根據(jù)細(xì)胞來(lái)源全能干細(xì)胞三胚層多能干細(xì)胞單胚層多能干細(xì)胞單能干細(xì)胞胚胎性干細(xì)胞成體干細(xì)胞生殖干細(xì)胞干細(xì)胞的橫向分化(transdifferentiation）---可塑性：成體干細(xì)胞具有分化成其他細(xì)胞或組織的潛能，大部分都可以分化為至少2～3種以上其它的組織細(xì)胞。

例如：從骨髓間質(zhì)中分離出的MAPC（多樣成熟原始細(xì)胞）干細(xì)胞、從臍血中分離出的干細(xì)胞，可以在體內(nèi)外分化出機(jī)體的任一組織。這種現(xiàn)象被稱(chēng)為干細(xì)胞的橫向分化。干細(xì)胞可塑性應(yīng)用該特性為干細(xì)胞的應(yīng)用研究開(kāi)創(chuàng)了更廣泛的空間，有望利用病人自身健康組織產(chǎn)生的干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化成可替代病變組織的功能細(xì)胞來(lái)治療各種疾病。這樣既克服了由于異體細(xì)胞移植而引起的免疫排斥，又避免了胚胎細(xì)胞來(lái)源不足以及其他社會(huì)倫理問(wèn)題。成體干細(xì)胞的可塑性間充質(zhì)干細(xì)胞主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，胎兒臍血中也可分離得到1.3干細(xì)胞的定位全能干細(xì)胞存在于桑葚胚以前的早期胚胎中胚胎干細(xì)胞存在于囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)成體干細(xì)胞存在于組織器官中造血干細(xì)胞分布于骨髓腔、外周血、胸腺、脾、肝等上皮干細(xì)胞存在于皮膚表皮底層毛囊隆突部、內(nèi)管腔上皮組織中神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于側(cè)腦室室管膜區(qū)、室下帶、大腦皮層、小腦皮層等部位肌組織干細(xì)胞其中的肌衛(wèi)星細(xì)胞，主要分布于肌纖維膜與基底膜之間2.干細(xì)胞的生物學(xué)特性及形態(tài)學(xué)特征

2.1干細(xì)胞的生物學(xué)特性①終生保持未分化或低分化狀態(tài)；②機(jī)體的數(shù)目、位置相對(duì)恒定；③具有自我更新能力；④能無(wú)限分裂增殖，干細(xì)胞可連續(xù)分裂幾代，也可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于靜止?fàn)顟B(tài)；⑤具有多向分化潛能，能分化為各種不同類(lèi)型的組織細(xì)胞，即具有分化發(fā)育的可塑性；⑥分裂周期慢，絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期；⑦干細(xì)胞通過(guò)兩種方式生長(zhǎng)：

對(duì)稱(chēng)分裂，形成兩個(gè)相同的干細(xì)胞，

非對(duì)稱(chēng)式分裂，非對(duì)稱(chēng)式分裂中一個(gè)保持親代的特性，仍作為干細(xì)胞保存下來(lái)，另外一個(gè)干細(xì)胞不可逆的走向分化的終端成為功能專(zhuān)一的分化細(xì)胞。

2.2干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

(1)ES細(xì)胞來(lái)自正常的胚胎，具有完整的二倍體核型。(2)胞體體積小、核大、胞漿少、有1～2個(gè)核仁，細(xì)胞緊集于一起，界限不清，呈集落型生長(zhǎng)，形似鳥(niǎo)巢，集落邊緣清晰，折光性強(qiáng)。(3）可以表達(dá)早期胚胎細(xì)胞特異表達(dá)的基因，如堿性磷酸酶基因(AKP)、高端粒酶基因活性。從基因表達(dá)看，ES細(xì)胞類(lèi)似晚期ICM細(xì)胞。(4）具有無(wú)限增殖能力。在適宜條件下，如放在飼養(yǎng)層上或含有分化抑制因子的培養(yǎng)基中，細(xì)胞可穩(wěn)定傳代，長(zhǎng)期培養(yǎng)。山羊EG細(xì)胞圖A原代培養(yǎng)的EG細(xì)胞集落；圖BEG集落AKP染色（引自KursadTurksen《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd），2006）AB(5)廣泛的體外分化能力。當(dāng)在培養(yǎng)環(huán)境中去除分化抑制因素或加入誘導(dǎo)分化物時(shí)，ES細(xì)胞可分化成來(lái)自三個(gè)胚層的細(xì)胞。(6)廣泛的體內(nèi)分化能力。將ES細(xì)胞接種到同種動(dòng)物或小鼠體內(nèi)，可分化產(chǎn)生由多種不同組織組成的畸胎瘤，包括來(lái)源于三個(gè)胚層的細(xì)胞。(7)具有種系傳遞功能。若把ES細(xì)胞注射到受體胚胎內(nèi)，ES細(xì)胞可廣泛參與胚胎各組織和器官、甚至胚胎生殖細(xì)胞的發(fā)育，形成種系嵌合體。(8)可在體外培養(yǎng)、克隆、凍存及進(jìn)行遺傳操作（如導(dǎo)入基因、標(biāo)記基因或剔除基因），因此可以通過(guò)它制備轉(zhuǎn)基因、基因缺失、突變、過(guò)表達(dá)的雜合或純合動(dòng)物，并可進(jìn)行各種基因功能分析。3、干細(xì)胞培養(yǎng)建系技術(shù)

3.1ES細(xì)胞的來(lái)源早期胚胎；從終止妊娠早期的胎兒組織中可分離出多能性干細(xì)胞；體細(xì)胞核移植胚胎。

（將去核的卵細(xì)胞與特定的單個(gè)體細(xì)胞用電融合法或化學(xué)融合法使兩細(xì)胞相融合，細(xì)胞分裂發(fā)育并形成胚囊，然后分離內(nèi)細(xì)胞群，獲得胚胎干細(xì)胞）。

3.2ES細(xì)胞的分離純化

3.2.1概念細(xì)胞分離(cellisolation)：指將組織材料分散制成組織懸液后，從中獲取目的細(xì)胞的過(guò)程。細(xì)胞純化(cellpurification)：更強(qiáng)調(diào)從原代培養(yǎng)前成分混雜的異質(zhì)性細(xì)胞懸液中，或者從培養(yǎng)物中獲得單一類(lèi)型細(xì)胞的過(guò)程。3.2.2ES的分離全胚培養(yǎng)法機(jī)械剝離培養(yǎng)法酶學(xué)解離培養(yǎng)法免疫外科法克隆法全胚培養(yǎng)法

將桑椹胚或囊胚直接培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上，讓其自然脫去透明帶，貼壁，與滋養(yǎng)層細(xì)胞一起增殖。當(dāng)ICM增殖垂直向上生長(zhǎng)一定時(shí)間后，挑出ICM，并離散成小細(xì)胞團(tuán)塊，進(jìn)行繼代培養(yǎng)，克隆擴(kuò)增。

機(jī)械分離法

采用機(jī)械方法除去胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)分離培養(yǎng)ICM。

用吸管或針頭捶打;

用組織研磨器或注射器研磨;

用不銹鋼或尼龍篩網(wǎng)搓洗等。

按照組織內(nèi)部同細(xì)胞的大小差異以一定孔徑的不銹鋼或尼龍篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞起到對(duì)細(xì)胞進(jìn)行初步分離純化的作用。酶學(xué)解離技術(shù)

包括用胰蛋白酶及鰲合劑處理、用緩沖液浸泡等。此法主要依據(jù)不同組織的細(xì)胞和間質(zhì)的構(gòu)成不同。免疫外科法首先用鏈霉蛋白酶將胚胎的透明帶除去，裸胚在抗體中處理一段時(shí)間后，再在補(bǔ)體中作用一段時(shí)間，使滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生溶解，然后直接對(duì)ICM進(jìn)行培養(yǎng)與擴(kuò)增。免疫外科法可選擇性的殺死胚囊外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞，而僅保留內(nèi)細(xì)胞中的團(tuán)細(xì)胞。

克隆法將成纖維細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因的成纖維細(xì)胞注入去核的哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞中，電融合或化學(xué)融合并激活，重組胚分裂至桑椹胚或囊胚，分離ES細(xì)胞與全胚培養(yǎng)法相同。以小鼠ES細(xì)胞分離為例：

（1）將胚泡與兔的抗小鼠的血清共同孵育一段時(shí)間；（2）加入補(bǔ)體；（3）在補(bǔ)體作用下外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生溶解（內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞不受影響）；（4）胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在體外適宜的生長(zhǎng)條件下形成多種細(xì)胞集落；（5）篩選出未分化的細(xì)胞集落，培養(yǎng)形成ES細(xì)胞系。3.3間充質(zhì)(messenchymalstemcell,MSC)干細(xì)胞的分離純化差速貼壁法：利用不同細(xì)胞貼壁時(shí)間不同進(jìn)行分離的方法（基于不同黏附特性的細(xì)胞分離方法），如利用成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和成鞘細(xì)胞的貼壁時(shí)間不同而將它們分離。如：葡聚糖凝膠G-10常用來(lái)分離細(xì)胞，其原理即利用細(xì)胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝膠，從而將異質(zhì)性細(xì)胞懸液中具有黏附能力的細(xì)胞去除。密度梯度離心法：利用不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí)，在一定離心力作用下，顆粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。

葉錦等(2010),利用密度梯度離心法和差速貼壁法獲得了高純度的肌源性干細(xì)胞，并成功擴(kuò)增。范萍等(2010),證明貼壁篩選法是理想的體外分離擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的培養(yǎng)體系，所培養(yǎng)的BMSCs純度高、生物學(xué)性狀穩(wěn)定。肖宏濤等(2010),利用貼壁法分離了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。以CO2窒息法處死大鼠，在無(wú)菌條件下取股骨和頸骨，除去骨表面附著組織，用PBS清洗干凈；用骨鉗除去股骨近端和頸骨遠(yuǎn)端，暴露骨髓腔，然后除去骨骺，并用大號(hào)針頭在骨端的生長(zhǎng)面上開(kāi)一個(gè)小孔；用注射器吸10mL含血清的培養(yǎng)液，將針頭從小孔插入骨髓腔中，注射培養(yǎng)液，從骨的另一端收集沖洗出來(lái)的骨髓；

間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化舉例：（1）鼠骨髓MSC的分離

將收獲的全部骨髓用注射器反復(fù)抽吸，以打散組織成為細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞懸液、離心；用含血清的培養(yǎng)液沖洗懸浮沉淀的細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸液與等量4%乙酸混合溶解紅細(xì)胞；計(jì)數(shù)有核的細(xì)胞，計(jì)算出細(xì)胞懸液中有核細(xì)胞的密度，并用含血清的培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度；然后將5×107個(gè)有核細(xì)胞接種到直徑為10cm的培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

（2）人骨髓MSC的分離

無(wú)菌抽取健康成人骨髓，加肝素抗凝。將肝素抗凝骨髓與等體積PBS混合，用吸管吹打分散細(xì)胞；室溫離心棄上清，加入PBS懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)密度為4×107個(gè)／mL；離心管中加入1.073g/mL的溶液，再將5mL細(xì)胞懸液鋪于其上，離心收集界面上的細(xì)胞，加入培養(yǎng)液清洗；離心收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48h后換液，以后每3-4d換液一次，當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞相互匯合達(dá)到90%的生長(zhǎng)表面時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA液消化分散細(xì)胞，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。（3）人臍帶血MSC的分離取足月正常生長(zhǎng)的胎兒臍帶血，加肝素抗凝；將肝素抗凝臍帶血與等體積PBS混合，然后按4：1與0.5%甲基纖維素混合，室溫沉降紅細(xì)胞30min；小心吸取上層液體，離心、棄上清，用PBS重懸細(xì)胞；在離心管中先加入1.077g/mL的溶液，再將5mL細(xì)胞懸液鋪于其上；離心，以下步驟同上。

3.4干細(xì)胞培養(yǎng)方法飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)法3.4.1飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)法(1)常用飼養(yǎng)層：小鼠胚胎成纖維細(xì)胞、STO細(xì)胞小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouseembryonicfibroblast,MEFs）

MEF作用:能抑制胚胎干細(xì)胞自主分化、有效促進(jìn)胚胎干細(xì)胞增殖，并維持其未分化的二倍體狀態(tài)和全能性。(2)MEF飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備

MEF的分離：將性成熟雌小鼠(7～8周齡)與種雄鼠(8周齡以上)2:1合籠，每天早上觀察雌小鼠生殖道口，有陰道栓形成即確定受孕，見(jiàn)栓當(dāng)天為懷孕0.5d；取妊娠12.5～14.5d的孕鼠,斷頸處死,無(wú)菌取出胚胎,洗除殘余血跡；去除胚胎頭、四肢、內(nèi)臟，剪軀干成1mm3碎塊，吸至離心管內(nèi)，加入等體積胰蛋白酶-EDTA消化液，吹打30次；細(xì)胞離散后,加入等體積MEF培養(yǎng)液，終止消化；800～1000r/min離心5min，棄上清液；加入5mL左右MEF培養(yǎng)液重懸鼠胚組織，制成細(xì)胞懸液,記數(shù)。

MEF的培養(yǎng)：原代培養(yǎng)：調(diào)整細(xì)胞濃度,接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)（一般5個(gè)鼠胚可使用1個(gè)100-150mL培養(yǎng)瓶），讓組織懸液能均勻覆蓋培養(yǎng)瓶表面，于37℃、5%CO2、飽和濕度，孵箱培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：待成纖維細(xì)胞基本鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿底，用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化吹打，置離心管靜置5min,取上層液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106～2×106個(gè)/mL（1:3比例），進(jìn)行傳代培養(yǎng)，一般采用3～5代作飼養(yǎng)細(xì)胞用。

MEF飼養(yǎng)層的制備：絲裂霉素C處理法、γ線(xiàn)照射法。一定劑量的絲裂霉素C（有絲分裂抑制劑）和γ射線(xiàn)能夠使細(xì)胞停止分裂，但又不立即死亡，在體外可維持一段存活時(shí)間。用這兩種方法處理飼養(yǎng)層細(xì)胞，可使飼養(yǎng)層細(xì)胞不分裂，又能存活，并分泌抑制ES細(xì)胞分化和促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的因子，保證ES細(xì)胞的生長(zhǎng)。MEF飼養(yǎng)層的制備：方法：絲裂霉素C處理法（有絲分裂抑制劑）、γ線(xiàn)照射法。作用：使細(xì)胞停止分裂，但又不立即死亡，并分泌抑制ES細(xì)胞分化和促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的因子，保證ES細(xì)胞的生長(zhǎng)。

絲裂霉素C法：

a.選取MEF細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的培養(yǎng)皿,加入絲裂霉素C10μg/mL（覆蓋細(xì)胞單層即可），處理2～3h；b.吸去處理液，用PBS標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液清洗2-3次,除去殘余絲裂霉素C；c.用0.25%胰酶、0.04%EDTA消化制成單細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞濃度為3.0×105個(gè)/mL，接種到用0.1％明膠預(yù)處理過(guò)的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。d.37℃、5％C02、100％濕度孵箱培養(yǎng)，細(xì)胞很快貼壁并鋪展為單層。這樣制成的飼養(yǎng)單層可使用6～10d，使用前更換成ES培養(yǎng)液，其它細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備方法基本同于MEF的制備。

γ射線(xiàn)處理法:

MEF或STO融合成單層后，用γ射線(xiàn)照射，劑量為30-100Gy，余下步驟同絲裂霉素C處理法。

（3）小鼠纖維母細(xì)胞（STO細(xì)胞）培養(yǎng)STO：SIM小鼠纖維母細(xì)胞的一種耐硫代鳥(niǎo)嘌呤（T）和耐鳥(niǎo)苯苷（O）亞系細(xì)胞。分泌：干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（stemcellgrowthfactor，SCGF）白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，LIF）抑制干細(xì)胞分化。STO代替MEF的優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞易于生長(zhǎng)及不需要經(jīng)常準(zhǔn)備懷孕母鼠，但STO細(xì)胞必須保持在最適生長(zhǎng)條件下，否則易于變異。目前已有穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了neor基因和UF基因的STO細(xì)胞株(如SNL細(xì)胞)，可用于ES細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和篩選。培養(yǎng)按一般細(xì)胞株，培養(yǎng)液同MEF。

3.4.2無(wú)飼養(yǎng)層培養(yǎng)(1)基本原理在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加ES細(xì)胞抑制分化因子，使ES細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下保持未分化狀態(tài)。(2)培養(yǎng)基的組成a.常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM、TCM-199、F-12等。

b.常用三種ES細(xì)胞培養(yǎng)液重組的LIF---白血病抑制因子，具有抑制胚胎干細(xì)胞自主分化的能力。BRL（Buffalo大鼠肝細(xì)胞株）條件培養(yǎng)基---能分泌一種抑制畸胎瘤和胚胎干細(xì)胞自主分化的因子。大鼠心肌條件培養(yǎng)基---能顯著促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。(3)ES細(xì)胞培養(yǎng)中常用添加物

血清巰基乙醇非必需氨基酸核苷酸

亞硒酸鈉和其他各種因子(4)ES細(xì)胞培養(yǎng)中常用的外源生長(zhǎng)因子表皮生長(zhǎng)因子(EGF)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)等。(5)培養(yǎng)方法

酶消化法：待胚胎發(fā)育至囊胚或孵化胚后，分離ICM細(xì)胞，實(shí)體顯微鏡下挑取形態(tài)典型的ICM集落；用0.25%胰酶和0.04%EDTA消化3～5min，轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行剝離ICM細(xì)胞；用孔徑適當(dāng)?shù)奈吖艽荡?，制成單?xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)塊，轉(zhuǎn)入條件培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

3.5ES細(xì)胞的原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)

3.5.1ES細(xì)胞的原代培養(yǎng)制備好MEF飼養(yǎng)層并添加相應(yīng)的ES細(xì)胞培養(yǎng)液，隔日將囊胚置入培養(yǎng)；培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、飽和濕度。挑取生長(zhǎng)良好，沒(méi)有分化跡象的ES/EG集落進(jìn)行消化擴(kuò)增。用胰蛋白酶消化巢狀胚胎干細(xì)胞團(tuán),繼續(xù)培養(yǎng)，一般間隔4～5d用胰蛋白酶消化成小細(xì)胞團(tuán)塊或單細(xì)胞，克隆和純化ES細(xì)胞。3.5.2ES細(xì)胞的傳代培養(yǎng)初次傳代后2～3d后將會(huì)出現(xiàn)小的ES細(xì)胞集落，待ES細(xì)胞集落充分增殖而不出現(xiàn)分化時(shí)重新離散，轉(zhuǎn)入新鮮飼養(yǎng)層上。經(jīng)數(shù)次分離純化后，ES細(xì)胞逐漸擴(kuò)增，每隔4～6d傳代一次。對(duì)ES／EG細(xì)胞進(jìn)行消化傳代總的原則是：盡量縮短酶消化作用時(shí)間，將細(xì)胞的損傷降到最低程度，且能將集落消化成小細(xì)胞團(tuán)塊。CDB猴ES細(xì)胞A貼壁培養(yǎng)的類(lèi)ES細(xì)胞；B酶消化處理后的ES細(xì)胞；C吸管吹打后形成的細(xì)胞簇；D傳代培養(yǎng)后1d形成的ES細(xì)胞集落（引自KursadTurksen.《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd）,2006）人胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）系的建立3.6ES細(xì)胞的冷凍與解凍

在ES細(xì)胞傳代過(guò)程中，需要不斷對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷存。因?yàn)镋S細(xì)胞的耐受性差，應(yīng)采用“慢凍-快溶”的方法，即冷凍時(shí)不宜過(guò)快，以保持ES細(xì)胞解凍后最大的存活率。取材處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ES單細(xì)胞懸浮液放入冷凍液中。冷凍液：75%DMEM+15%新生牛血清(NCS)+10%DMSO（用時(shí)配制）冷凍：冷凍開(kāi)始溫度下降速度保持在13℃／min為宜，當(dāng)溫度下降到－20℃左右時(shí)，下降速度可調(diào)為5℃／min，到－100℃左右時(shí)，可迅速投入液氮中。解凍：從液氮中取出冷凍管，投入37℃水浴至全部溶解，75％的酒精消毒冷凍管外壁，立即加入ES細(xì)胞培養(yǎng)液，離心2次除去冷凍液，棄去上清，以培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3.7ES和EG細(xì)胞系的特性和鑒定

3.7.1ES/EG細(xì)胞系的特性（1）無(wú)限增殖性在不分化前提下，ES細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖迅速，每18～24h增殖一次，細(xì)胞隨著增殖次數(shù)的增加而活力并不減弱，增殖過(guò)程中細(xì)胞大多處于S期，進(jìn)行DNA合成。（2）分化潛能性高分化潛能：具有高度分化潛能，可分化形成包括三個(gè)胚層在內(nèi)的各種類(lèi)型細(xì)胞（血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等）。定向分化：ES細(xì)胞在體外某些物質(zhì)誘導(dǎo)下可以發(fā)生定向分化，如用造血基質(zhì)細(xì)胞、不同造血生長(zhǎng)因子對(duì)單層培養(yǎng)的ES細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，可形成各階段的造血細(xì)胞。（3）種系傳遞性將ES細(xì)胞注入囊胚后發(fā)育，可獲得嵌合體，并參與生殖細(xì)胞的形成。在嵌合體中一部分組織和細(xì)胞來(lái)源于受體囊胚細(xì)胞，而另一部分來(lái)源于ES細(xì)胞?；谄浞N系傳遞特性，可在ES細(xì)胞水平進(jìn)行基因打靶等操作，研究基因在個(gè)體發(fā)育中的作用。3.7.2ES/EG細(xì)胞的鑒定

ES/EG細(xì)胞經(jīng)分離培養(yǎng)，最終建立細(xì)胞系，需要根據(jù)其細(xì)胞特性進(jìn)行一系列鑒定，以了解是否分化變異、干細(xì)胞的特性或能力是否喪失。鑒定方法：形態(tài)學(xué)特征；特異性標(biāo)志分子的表達(dá)；分化潛能測(cè)定。1.形態(tài)學(xué)特征ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、核型特征：ES細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)(胞體體積小、核大、有一個(gè)或幾個(gè)核仁)和生長(zhǎng)特性(呈克隆狀生長(zhǎng),細(xì)胞緊密聚集,形似鳥(niǎo)巢,界限不清等)對(duì)ES細(xì)胞鑒定。不同ES細(xì)胞形態(tài)不同，鼠ES細(xì)胞集落一般呈緊密的球形，靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的ES細(xì)胞集落相對(duì)較為扁平。2.細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定(1)堿性磷酸酶的表達(dá)檢測(cè)（alkalinephosphatase，AKP）：AKP常用來(lái)作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一，未分化ES細(xì)胞表面標(biāo)記AKP呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞一旦分化，則AKP呈陰性。可用AKP染色的方法進(jìn)行AKP檢測(cè)。2.細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定(2)胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達(dá)檢測(cè)早期胚胎細(xì)胞表面均表達(dá)“胚胎階段特異性表面抗原”（stage-specificembryonicantigen，SSEA）：SSEA是一種糖蛋白，在未分化多能干細(xì)胞中SSEA為陽(yáng)性，反之呈陰性。(3)Oct-4轉(zhuǎn)錄子表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄因子Oct-4在多能胚胎干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞中得到表達(dá)。當(dāng)全能細(xì)胞分化形成體細(xì)胞或胚外組織時(shí)，該基因則不再表達(dá)。Oct-4基因在維持ES細(xì)胞和原腸胚階段原始生殖細(xì)胞全能性表型起著非常重要的作用?？梢設(shè)ct-4基因的存在與否作為ES細(xì)胞鑒定的指標(biāo)之一。(4)ES細(xì)胞的端粒酶活性生殖細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞具有較高的端粒酶活性。隨著機(jī)體組織、細(xì)胞的分化，端粒酶活性逐漸降低，所以正常體細(xì)胞一般無(wú)端粒酶活性。舉例：胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原（SSEA）的檢測(cè)

鼠、人ESC表達(dá)的表面抗原具有種屬差異性。小鼠：表達(dá)早期胚胎特異性抗原SSEA-1,不表達(dá)SSEA-3、SSEA-4。

人：表達(dá)SSEA-３、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81,不表達(dá)SSEA-1。其中SSEA-4一直呈強(qiáng)陽(yáng)性，SSEA-3為弱陽(yáng)性,已分化的ESC的SSEA-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。體外誘導(dǎo)分化14d的criptoES細(xì)胞用antiⅢ-tubulin抗體免疫熒光染色分析顯示ES細(xì)胞分化成神經(jīng)細(xì)胞（引自KursadTurksen.《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd），2006）人原始生殖嵴細(xì)胞（PGC）分離的EGC的SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81均表現(xiàn)為陽(yáng)性。家兔SSEA-1的表達(dá)與小鼠的基本相似，桑椹胚卵裂球和早期囊胚細(xì)胞呈陽(yáng)性，晚期囊胚中部分呈陽(yáng)性，部分呈弱陽(yáng)性，少部分呈陰性。因此，常用SSEA-1單克隆抗體來(lái)檢測(cè)ESC。馬ES細(xì)胞的分子標(biāo)記表達(dá)（引自KursadTurksen.《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd），2006）圖A：ES細(xì)胞AKP染色陽(yáng)性B：大部分ES細(xì)胞STAT3特異性抗體免疫組化染色陽(yáng)性

小鼠ES細(xì)胞檢測(cè)⑤核型的檢測(cè)使胚胎干細(xì)胞保證正常的核型非常重要，只有具有正常核型的胚胎干細(xì)胞才能嵌合到宿主著床前胚胎內(nèi)，共同分化發(fā)育成嵌合體動(dòng)物；為了進(jìn)一步鑒定，還可以染色體帶型分析。染色體聯(lián)會(huì)復(fù)合體的分析（3）分化能力檢測(cè)體外分化實(shí)驗(yàn)

將所得細(xì)胞制成懸液培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，如所得細(xì)胞為ESC，則在培養(yǎng)過(guò)程中部分細(xì)胞聚集貼壁;培養(yǎng)一段時(shí)間后將會(huì)分化為神經(jīng)、肌肉、軟骨等不同組織細(xì)胞，同時(shí)還有部分細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，先形成簡(jiǎn)單類(lèi)胚體，進(jìn)一步形成囊狀胚體。根據(jù)ES細(xì)胞分化程度不同，可初步了解其分化能力的強(qiáng)弱。體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)以一定量所得細(xì)胞腹股溝接種或腹腔注射到同源動(dòng)物或免疫缺陷小鼠體內(nèi)，若為ESC，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，動(dòng)物注射處可見(jiàn)有組織瘤生成。手術(shù)取瘤，常規(guī)制作切片觀察，可見(jiàn)代表內(nèi)胚層、中胚層和外胚層３個(gè)胚層的不同組織細(xì)胞。體外分化實(shí)驗(yàn)體

內(nèi)

分

化

實(shí)

驗(yàn)（4）嵌合體的形成利用囊胚注射法，應(yīng)用顯微注射儀將ES細(xì)胞注射到受體囊胚腔，使其與正常胚胎結(jié)合在一起，再移植到假孕母鼠子宮腔（胚胎移植），使之發(fā)育成個(gè)體。如果ES細(xì)胞具嵌合能力，則會(huì)融合到宿主胚胎細(xì)胞中，并共同分化發(fā)育成各種組織細(xì)胞，并產(chǎn)生嵌合體小鼠，嵌合體動(dòng)物可以通過(guò)皮毛顏色、蛋白質(zhì)、DNA指紋、同工酶等進(jìn)行檢測(cè)。而ES細(xì)胞一旦分化即喪失全能性，便難以參與胚胎發(fā)育形成嵌合體。NTESTetra-cloneDifferentiationDonor

3.8

ES/EG細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化3.8.1ES/EG細(xì)胞維持未分化的分子機(jī)制(1)維持ES細(xì)胞未分化關(guān)鍵因子LIF/STAT3通路(signaltransducersandactivatorsoftranscrption):通過(guò)復(fù)合物gp130磷酸化效應(yīng)分子的酪氨酸殘基，將信息傳至細(xì)胞核內(nèi)相應(yīng)的靶基因上，而使細(xì)胞處于高度增殖狀態(tài)。轉(zhuǎn)錄因子Oct-4/3：可使ES細(xì)胞維持未分化狀態(tài)。（2）LIF/STAT3通路LIF是通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。LIF受體(LIFR)廣泛分布在體細(xì)胞上，是一種分子量為250KDa的糖蛋白，LIF與其受體結(jié)合后，可激活結(jié)合于gp130胞內(nèi)近膜部分的JKA激酶，活化的JKA激酶催化gp130胞漿區(qū)的酪氨酸磷酸化，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子STAT，活化的STAT形成同源二聚體并移向核內(nèi)，與核內(nèi)特異的靶細(xì)胞基因位點(diǎn)結(jié)合,并激活STAT1與STAT3，STAT3是維持ES細(xì)胞不分化狀態(tài)的決定性因子，被激活后就足以抑制ES細(xì)胞的分化。（3）Oct-4Oct-4基因表達(dá)上調(diào)2倍可使ES細(xì)胞分化為原始內(nèi)胚層細(xì)胞；表達(dá)程度不變可維持ES細(xì)胞未分化狀態(tài)；表達(dá)下調(diào)可使ES細(xì)胞分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞。在ES細(xì)胞發(fā)生自發(fā)分化的過(guò)程中，仍有一定水平的Oct-4表達(dá)。說(shuō)明Oct-4基因的表達(dá)是維持ES細(xì)胞未分化狀態(tài)的必要條件，但不是充分條件，還需LIF等其它因子的協(xié)同作用。通過(guò)對(duì)這些信號(hào)途徑的研究，發(fā)現(xiàn)只有這些因子處于一種特定的平衡狀態(tài)時(shí)，ES細(xì)胞才會(huì)保持一種未分化的自我更新?tīng)顟B(tài)，一旦平衡移動(dòng)了，ES細(xì)胞就會(huì)開(kāi)始分化。干細(xì)胞在體外培養(yǎng)需要抑制其分化，目前在體外維持胚胎性干細(xì)胞自我更新手段：（1）使用飼養(yǎng)層細(xì)胞（STO、MEF）。（2）條件培養(yǎng)基（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基中的物質(zhì)，如生長(zhǎng)因子中的LIF、白介素-6、制瘤素M、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等）。（3）直接加入抑制分化的細(xì)胞因子，如白血病抑制因子等。3.8.2ES細(xì)胞體外分化的基本原理分化模式：自發(fā)分化誘導(dǎo)分化基因調(diào)控分化（1）自發(fā)分化是指ES/EG細(xì)胞在體外呈單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，會(huì)形成由多種類(lèi)型細(xì)胞組合的類(lèi)胚體，在加入生長(zhǎng)因子干預(yù)后能夠增加某一類(lèi)型細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。如形成有搏動(dòng)功能的心肌細(xì)胞，這些細(xì)胞具有胎兒心肌細(xì)胞的特性。（2）誘導(dǎo)分化途徑：共培養(yǎng)：將ES細(xì)胞與不同類(lèi)型的細(xì)胞共同培養(yǎng)。添加分化誘導(dǎo)因子：視黃酸(retinoicacid，RA)、DMSO、3-甲氧苯丙胺、神經(jīng)生長(zhǎng)因子等。例如：骨髓基質(zhì)細(xì)胞或OP9細(xì)胞可誘導(dǎo)ES細(xì)胞向造血干細(xì)胞分化；PA6細(xì)胞可促進(jìn)ES細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化；DMSO和丁酸鈉可依次誘導(dǎo)ES細(xì)胞形成肝細(xì)胞。（3）基因調(diào)控分化基因調(diào)控分化——強(qiáng)化或抑制某些基因表達(dá)，形成單一譜系所特有的基因表達(dá)方式，定向誘導(dǎo)ES細(xì)胞的分化。例如：將TATPDX1融合蛋白轉(zhuǎn)入hES細(xì)胞，激活下游靶基因的表達(dá)，可促進(jìn)干細(xì)胞胰島素分泌，有助于干細(xì)胞向胰島細(xì)胞的分化。3.8.3體外誘導(dǎo)分化的方法基因外誘導(dǎo)（epigeneticmanipulation）基因修飾（geneticmethods）（1）基因外誘導(dǎo)誘導(dǎo)劑法序貫誘導(dǎo)法特殊誘導(dǎo)法

a.誘導(dǎo)劑法誘導(dǎo)劑—視黃酸（RA），常用于誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化。誘導(dǎo)機(jī)制—通過(guò)ES細(xì)胞結(jié)合