1株莢膜血清a型巴氏桿菌的分離鑒定

1株莢膜血清a型巴氏桿菌的分離鑒定

巴氏桿菌是一種條件性疾病。這種疾病通常生長(zhǎng)在總理和猴子的粘膜和扁桃體上。由于其他致病性因素的相互作用，身體的吸引力降低，細(xì)菌在兔子體內(nèi)廣泛繁殖，導(dǎo)致兔子病情惡化（郭慧霞等，2010；劉繼山等，2013）。長(zhǎng)毛兔飼養(yǎng)周期較長(zhǎng),鼻炎、肺炎、中耳炎的發(fā)生率居高不下,一直是影響長(zhǎng)毛兔健康狀況,也是決定其淘汰率的一大因素。山東某大型長(zhǎng)毛兔養(yǎng)殖場(chǎng)成年家兔發(fā)生了一種以肺臟出血、化膿、壞死等為癥狀的疾病,該病能導(dǎo)致家兔消瘦、零星死亡,占總死亡率的60%以上,特別是進(jìn)入夏季以來(lái)其淘汰率進(jìn)一步上升,一度達(dá)月死亡率的5%以上,年淘汰率達(dá)到60%。病死長(zhǎng)毛免的臨床癥狀:病兔消瘦、骨瘦如柴,毛色不光滑、沒(méi)有光澤、密度小,呼吸急促、腹式呼吸,鼻部潮濕、有膿性分泌物,食欲基本正常,糞便基本正常,未表現(xiàn)明顯的其他臨床癥狀(劉吉山等,2013)。其剖檢變化:主要集中于呼吸道和肺臟,鼻竇內(nèi)有白色奶油狀分泌物,有的呈干酪樣物質(zhì),氣管內(nèi)黏液增多,氣管出血,胸腔內(nèi)積滿(mǎn)膿汁,心包黏連,胸腔黏連,單側(cè)肺臟或雙側(cè)肺臟幾乎消失,充滿(mǎn)白色膿汁或奶油色干酪樣物質(zhì)(圖1、2)。鑒于病死兔的臨床癥狀及病理變化,作者在實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行了病原分離、生化試驗(yàn)、16SrRNA鑒定、藥敏試驗(yàn)、動(dòng)物試驗(yàn)及本場(chǎng)疫苗的制備與免疫試驗(yàn)。為對(duì)該病進(jìn)行有效防控,本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了3組防控措施,經(jīng)征得場(chǎng)主同意,在該兔場(chǎng)進(jìn)行了一系列臨床試驗(yàn),通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)篩選出了一組最為有效的防治措施,并對(duì)該場(chǎng)進(jìn)行了全場(chǎng)防控,取得了較好效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1疾病信息來(lái)源1.1.2基材料藥敏紙片購(gòu)自北京天壇藥物生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司;微量糖發(fā)酵管購(gòu)自上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠(chǎng);麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物工程有限公司;馬丁肉湯購(gòu)自山東雨林生物制品有限公司,按說(shuō)明書(shū)配制,滅菌后加入1%裂解血和4%雞血清;馬丁血清裂解血平板在以上基礎(chǔ)上加入2%瓊脂粉,滅菌,傾倒平板即可(陳天壽,1994)。明膠、MR等生化培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制(程安春,1997)。1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物8只體重2.5kg日本大耳白兔、9只18~22g昆明Ⅱ系小白鼠均由山東綠都生物科技有限公司動(dòng)物試驗(yàn)中心提供。1.2方法1.2.1細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和純度陸成平，20011.2.1.血清裂解血平板的制備無(wú)菌取病料中的肺臟小膿腫膿液,無(wú)菌條件下用接種環(huán)劃線(xiàn)接種于馬丁血清裂解血平板上,37℃培養(yǎng)24h。同時(shí)將膿液和培養(yǎng)物涂片后進(jìn)行美蘭及革蘭氏染色,油鏡鏡檢,記錄結(jié)果。1.2.1.2.細(xì)菌分離和純度挑取平板上單個(gè)典型菌落接種于馬丁血清裂解血平板上,37℃培養(yǎng)24h。將純化細(xì)菌接種于麥康凱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h,觀(guān)察結(jié)果。1.2.2抑菌圈的測(cè)定藥敏試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。從37℃孵育18h的馬丁血清裂解血平板上分別取菌苔于滅菌生理鹽水中,并將其懸液濁度用生理鹽水調(diào)至0.5濁度麥?zhǔn)?直接用此鹽水懸液作為接種物。無(wú)菌棉簽蘸取上述懸液,均勻涂布于9cm馬丁血清裂解血平板。待稍干后,用無(wú)菌鑷子取替米考星(T)、氟苯尼考(F)、恩諾沙星(ENO)、慶大霉素(GM)、頭孢噻呋鈉(CF)、阿莫西林(AMX)、環(huán)丙沙星(CIP)、磷霉素(FOS)、氧氟沙星(OFL)、硫酸新霉素(N)10種常用藥敏紙片(紙片直徑6.3~6.4mm)平貼在培養(yǎng)基表面,4℃放置2h使藥物擴(kuò)散,然后37℃培養(yǎng)20~24h后觀(guān)察測(cè)量抑菌圈的大小并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為:抑菌圈直徑<10mm為耐藥;直徑在14~16mm之間為中度敏感,直徑>16mm為敏感。1.2.3糖、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、糖、鼠李糖、糖、糖、玉米糖、m、明膠將分離菌純培養(yǎng)物接種于微量糖發(fā)酵管(包括蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇、甘露糖、MR、明膠等),37℃培養(yǎng)72h后記錄生化試驗(yàn)結(jié)果(徐剛等,2012)。1.2.4引物的合成按照莢膜血清A型巴氏桿菌特異性序列設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增16SrRNA的引物。引物序列為:s1-a:5′-TGCCAAAATCGCAGT-CAG-3′;s2-a:5′-TTGCCATCATTGTCAGTG-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1040bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。退火溫度為55℃,反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按常規(guī)進(jìn)行,對(duì)分離菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定(奎玲等,2011)。1.2.5動(dòng)物疾病試驗(yàn)1.2.5.人工感染途徑檢測(cè)取9只健康昆明Ⅱ系小白鼠,5只試驗(yàn)組昆明Ⅱ系小白鼠腹腔接種上述懸濁液0.1mL/只(約108CFU),4只對(duì)照組昆明Ⅱ系小白鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水,連續(xù)觀(guān)察7d,觀(guān)察并記錄發(fā)病和死亡情況(奎玲等,2011)。1.2.5.日本大耳白兔發(fā)病條件觀(guān)察取分離菌培養(yǎng)物接種4只日本大耳白兔,靜脈注射1.0mL(約109CFU),連續(xù)觀(guān)察14d,同時(shí)設(shè)4只對(duì)照,分別注射1.0mL生理鹽水。日本大耳白兔發(fā)病的臨床標(biāo)準(zhǔn)為鼻部潮濕、有鼻炎、流膿性鼻液。觀(guān)察并記錄發(fā)病和死亡情況并逐只剖檢觀(guān)察病變。1.2.6疫苗準(zhǔn)備1.2.6.解血工藝、培養(yǎng)、冷藏將純化、鑒定后的分離菌接種含4%雞血清、1%裂解血的馬丁肉湯,高密度通氣發(fā)酵培養(yǎng),37℃培養(yǎng)12h,培養(yǎng)物加入1‰福爾馬林溶液,37℃滅活24h,無(wú)菌檢驗(yàn)合格后,于4℃冷藏備用。1.2.6.2.制備疫苗1.2.7試驗(yàn)2:長(zhǎng)毛兔逐步血清試驗(yàn)應(yīng)用1.2.6制備的巴氏桿菌本場(chǎng)疫苗進(jìn)行免疫。在養(yǎng)殖場(chǎng)試驗(yàn)區(qū),挑出明顯消瘦及有明顯呼吸道癥狀和嚴(yán)重鼻炎的病兔,不參與試驗(yàn);有輕微鼻炎癥狀的長(zhǎng)毛兔參與試驗(yàn),選取2300只,籠位相鄰的24月齡長(zhǎng)毛兔進(jìn)行試驗(yàn)。共設(shè)試驗(yàn)A、B、C3組,分別為巴氏桿菌本場(chǎng)疫苗免疫試驗(yàn)組、恩諾沙星防治試驗(yàn)組、巴氏桿菌本場(chǎng)疫苗免疫與恩諾沙星聯(lián)用試驗(yàn)組,另設(shè)1個(gè)對(duì)照組。試驗(yàn)A、C組提前免疫,與試驗(yàn)B組及對(duì)照組同時(shí)觀(guān)察至30d。死亡長(zhǎng)毛兔逐只剖檢,觀(guān)察其肺臟病變。檢查肺臟是否有大面積出血、壞死、化膿,癥狀符合其一,確定為肺炎死亡指征。試驗(yàn)A組:取600只成年長(zhǎng)毛兔,頸部皮下注射1.0mL/(只·次),連續(xù)免疫2次,每次相隔1周,隨機(jī)選擇其中500只,自第2次免疫后第4天開(kāi)始觀(guān)察,每隔2d記錄1次死亡只數(shù),連續(xù)觀(guān)察30d,記錄結(jié)果。試驗(yàn)B組:取恩諾沙星,按24mg/只(一般3.5~4kg/只),隨機(jī)選擇500只成年長(zhǎng)毛兔投喂,每天1次,連用4d,從第1天開(kāi)始觀(guān)察結(jié)果,每2d記錄1次死亡情況,連續(xù)記錄30d。試驗(yàn)C組:取600只成年長(zhǎng)毛兔,頸部皮下注射1.0mL/(只·次),連續(xù)免疫2次,間隔1周,且在第2次免疫后第4天投喂恩諾沙星,按24mg/只(一般3.5~4kg/只),每天1次,連用4d。同時(shí),自投藥后第1天隨機(jī)選擇其中500只長(zhǎng)毛兔開(kāi)始觀(guān)察,每隔2d記錄1次死亡只數(shù),連續(xù)觀(guān)察30d,記錄結(jié)果。對(duì)照組:取相鄰區(qū)域500只成年長(zhǎng)毛兔作為對(duì)照組,不采取任何處理措施,正常飼喂,記錄觀(guān)察結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1革蘭氏陰性球桿菌的分離和鑒定在馬丁血清裂解血平板上37℃培養(yǎng)24h后,形成圓形、凸起、光滑透明、邊緣整齊、濕潤(rùn)的露珠樣菌落,直徑為1~2mm。膿液和培養(yǎng)物鏡檢均發(fā)現(xiàn),該分離菌為革蘭氏陰性球桿菌,單個(gè)或成對(duì)存在;美蘭染色為兩極著色的小桿菌,膿液中細(xì)菌和培養(yǎng)物的細(xì)菌形態(tài)一致。接種麥康凱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h,不生長(zhǎng)。分離菌命名為sd-1株。2.2藥物敏感試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離菌sd-1對(duì)替米考星(T)、恩諾沙星(ENO)、氟苯尼考(F)、慶大霉素(GM)、頭孢噻呋鈉(CF)、阿莫西林(AMX)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、磷霉素(FOS)敏感;對(duì)硫酸新霉素(N)中度敏感。其中,替米考星、恩諾沙星、氟苯尼考最為敏感,所產(chǎn)生的抑菌圈最大,達(dá)30mm以上。2.3德維護(hù)斯的分離2.3.1糖酸糖產(chǎn)酸液sd-1株的生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1得知,sd-1株發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、鼠李糖;不液化明膠,MR試驗(yàn)陰性,吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性,觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性,硝酸鹽還原陽(yáng)性,在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng),符合巴氏桿菌的生化特征,推測(cè)sd-1株為巴氏桿菌。2.3.2大小片段的估計(jì)sd-1株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知,能得到大小為1040bp的片段,與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)合分離培養(yǎng)、鏡檢結(jié)果及生化試驗(yàn)結(jié)果,可證實(shí)sd-1株為莢膜血清A型巴氏桿菌。2.4動(dòng)物疾病試驗(yàn)2.4.1攻毒臨床性狀觀(guān)察昆明Ⅱ系小白鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,觀(guān)察7d,sd-1株攻毒昆明Ⅱ系小白鼠5只,全部死亡,對(duì)照組4只全部健活,表明sd-1株有較強(qiáng)的致病性。2.4.2對(duì)日本大耳白兔的安全性由表3可知,sd-1株攻毒4只日本大耳白兔,2只死亡,2只發(fā)病,發(fā)病率100%,對(duì)照組4只全部健活。表明sd-1株對(duì)日本大耳白兔有一定的致病性,在短時(shí)間內(nèi),部分不死亡,但臨床癥狀明顯。剖檢死亡兔發(fā)現(xiàn),第4天死亡的兔子肺臟僅見(jiàn)大面積出血及少量化膿灶,第8天死亡的兔子,肺臟出現(xiàn)了化膿性肺炎。將2只存活發(fā)病兔剖檢發(fā)現(xiàn)一側(cè)肺化膿、壞死,充滿(mǎn)米粒大小的化膿灶,內(nèi)有奶油色膿汁,另一側(cè)肺臟少量出血。從發(fā)病及死亡兔肺臟均分離到攻毒細(xì)菌。2.5死亡率和藥物狀態(tài)長(zhǎng)毛兔綜合防控試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,用藥30d后試驗(yàn)A、B、C組以肺炎為死亡指征的死亡率分別為1.6%、2.4%、1.0%,均低于對(duì)照組(4.4%)。試驗(yàn)C組的鼻炎明顯少,但試驗(yàn)B組30d后鼻炎有明顯的增加,且死亡率也有明顯的回升;而試驗(yàn)C組前期死亡率較低,鼻炎回升也很慢,癥狀輕微;試驗(yàn)A組前期死亡率高,后期鼻炎發(fā)生率不高,癥狀很輕微。3討論3.1巴氏桿菌對(duì)日本大耳白兔致病性的影響sd-1株分離菌革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性球桿菌,單個(gè)或成對(duì)存在;美蘭染色為兩極著色。麥康凱培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h,不生長(zhǎng)。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示符合巴氏桿菌特點(diǎn)。分子生物學(xué)檢測(cè)顯示為莢膜血清A型巴氏桿菌。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果表明,該菌有足夠的致病力引起日本大耳白兔發(fā)生化膿性肺炎而引發(fā)死亡。由此,確定此次發(fā)病由莢膜血清A型巴氏桿菌引起。巴氏桿菌可引起日本大耳白兔的鼻炎、肺炎、敗血癥、結(jié)膜炎、中耳炎、子宮睪丸炎等(王振華,2012),其多樣性在臨床上常令獸醫(yī)陷入誤診。此次巴氏桿菌病并未引起日本大耳白兔的急性死亡(敗血癥),而是引起化膿性肺炎及鼻炎癥狀,與高光明等(2010)、郭慧霞等(2010)、徐剛等(2012)報(bào)道的有所不同,據(jù)筆者觀(guān)察在日本大耳白兔所發(fā)生的巴氏桿菌病中以鼻炎、化膿性肺炎、結(jié)膜炎、中耳炎及子宮睪丸炎等癥狀的病例較多,而以敗血癥為特征的急性死亡病例在臨床實(shí)踐中并不多見(jiàn)。3.2分離菌sd-1的耐藥鑒定藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,sd-1株對(duì)替米考星(T)、恩諾沙星(ENO)、氟苯尼考(F)、慶大霉素(GM)、頭孢噻呋鈉(CF)、阿莫西林(AMX)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、磷霉素(FOS)敏感;對(duì)硫酸新霉素(N)中度敏感,也說(shuō)明了分離菌sd-1株對(duì)多種藥物很敏感,應(yīng)用大部分藥物可有效控制。但此次發(fā)病,單獨(dú)藥物控制難以完全有效控制。孫寶瑩等(2004)報(bào)道兔巴氏桿菌耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重,多數(shù)為多重耐藥,且對(duì)青霉素類(lèi)、氟苯尼考及利福平敏感性較高,建議應(yīng)用氟苯尼考治療,但敏感藥物臨床應(yīng)用是否會(huì)引發(fā)其他有害副作用,并未提及。筆者在臨床實(shí)踐中使用廣譜抗菌藥物,如利福平、氟苯尼考等,常會(huì)引發(fā)家兔腹瀉等癥狀,從而引起家兔大批死亡的病例并不少見(jiàn),因此,建議在家兔臨床中慎用廣譜抗菌藥物,必須要用時(shí),最好通過(guò)肌肉或靜脈給藥,防止發(fā)生意外。3.3試驗(yàn)結(jié)果及分析試驗(yàn)A和C組的死淘率分別為1.6%、1.0%,B組的死淘率為2.4%,都明顯低于對(duì)照組的死淘率4.4%,說(shuō)明3種防控方法均有療效,其中以試驗(yàn)C組為最好,即巴氏桿菌本場(chǎng)疫苗免疫和恩諾沙星聯(lián)用試驗(yàn)組。試驗(yàn)B組明顯不如試驗(yàn)A、C組,試驗(yàn)B組用完藥物30d后,新的疫情又開(kāi)始了,又恢復(fù)到原來(lái)的狀態(tài)。而試驗(yàn)A、C組一直保持低肺炎死亡率狀態(tài),在免疫30d后死亡的兔子肺臟中未再次分離到巴氏桿菌,說(shuō)明應(yīng)用巴氏桿菌本場(chǎng)疫苗能有效控制莢膜血清A型巴氏桿菌病。通過(guò)防治試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論用疫苗免疫還是用恩諾沙星投藥,剛開(kāi)始采取措施之后10d內(nèi)死亡率沒(méi)有很明顯的起色,隨著日期的延長(zhǎng),死亡率進(jìn)一步下降,筆者認(rèn)為,這種現(xiàn)象可能是因?yàn)楹芏啾砻娼】低靡呀?jīng)發(fā)病且陷入嚴(yán)重肺炎狀態(tài),但未觀(guān)察到臨床癥狀,隨著時(shí)間延長(zhǎng),癥狀加重而死亡。而之后死亡率降低可能是恩諾沙星起到了前期殺滅細(xì)菌,抑制了細(xì)菌的增殖。巴氏桿菌本場(chǎng)疫苗免疫組則是前期抗體未達(dá)到相當(dāng)高的滴度,尚