1株莢膜血清a型巴氏桿菌的分離鑒定

1株莢膜血清a型巴氏桿菌的分離鑒定

巴氏桿菌是一種條件性疾病。這種疾病通常生長在總理和猴子的粘膜和扁桃體上。由于其他致病性因素的相互作用，身體的吸引力降低，細(xì)菌在兔子體內(nèi)廣泛繁殖，導(dǎo)致兔子病情惡化（郭慧霞等，2010；劉繼山等，2013）。長毛兔飼養(yǎng)周期較長,鼻炎、肺炎、中耳炎的發(fā)生率居高不下,一直是影響長毛兔健康狀況,也是決定其淘汰率的一大因素。山東某大型長毛兔養(yǎng)殖場成年家兔發(fā)生了一種以肺臟出血、化膿、壞死等為癥狀的疾病,該病能導(dǎo)致家兔消瘦、零星死亡,占總死亡率的60%以上,特別是進(jìn)入夏季以來其淘汰率進(jìn)一步上升,一度達(dá)月死亡率的5%以上,年淘汰率達(dá)到60%。病死長毛免的臨床癥狀:病兔消瘦、骨瘦如柴,毛色不光滑、沒有光澤、密度小,呼吸急促、腹式呼吸,鼻部潮濕、有膿性分泌物,食欲基本正常,糞便基本正常,未表現(xiàn)明顯的其他臨床癥狀(劉吉山等,2013)。其剖檢變化:主要集中于呼吸道和肺臟,鼻竇內(nèi)有白色奶油狀分泌物,有的呈干酪樣物質(zhì),氣管內(nèi)黏液增多,氣管出血,胸腔內(nèi)積滿膿汁,心包黏連,胸腔黏連,單側(cè)肺臟或雙側(cè)肺臟幾乎消失,充滿白色膿汁或奶油色干酪樣物質(zhì)(圖1、2)。鑒于病死兔的臨床癥狀及病理變化,作者在實驗室對其進(jìn)行了病原分離、生化試驗、16SrRNA鑒定、藥敏試驗、動物試驗及本場疫苗的制備與免疫試驗。為對該病進(jìn)行有效防控,本試驗設(shè)計了3組防控措施,經(jīng)征得場主同意,在該兔場進(jìn)行了一系列臨床試驗,通過對比試驗篩選出了一組最為有效的防治措施,并對該場進(jìn)行了全場防控,取得了較好效果。1材料和方法1.1材料表面1.1.1疾病信息來源1.1.2基材料藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司;微量糖發(fā)酵管購自上海市醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠;麥康凱培養(yǎng)基購自青島海博生物工程有限公司;馬丁肉湯購自山東雨林生物制品有限公司,按說明書配制,滅菌后加入1%裂解血和4%雞血清;馬丁血清裂解血平板在以上基礎(chǔ)上加入2%瓊脂粉,滅菌,傾倒平板即可(陳天壽,1994)。明膠、MR等生化培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制(程安春,1997)。1.1.3試驗動物8只體重2.5kg日本大耳白兔、9只18~22g昆明Ⅱ系小白鼠均由山東綠都生物科技有限公司動物試驗中心提供。1.2方法1.2.1細(xì)菌的分離、培養(yǎng)和純度陸成平，20011.2.1.血清裂解血平板的制備無菌取病料中的肺臟小膿腫膿液,無菌條件下用接種環(huán)劃線接種于馬丁血清裂解血平板上,37℃培養(yǎng)24h。同時將膿液和培養(yǎng)物涂片后進(jìn)行美蘭及革蘭氏染色,油鏡鏡檢,記錄結(jié)果。1.2.1.2.細(xì)菌分離和純度挑取平板上單個典型菌落接種于馬丁血清裂解血平板上,37℃培養(yǎng)24h。將純化細(xì)菌接種于麥康凱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h,觀察結(jié)果。1.2.2抑菌圈的測定藥敏試驗采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。從37℃孵育18h的馬丁血清裂解血平板上分別取菌苔于滅菌生理鹽水中,并將其懸液濁度用生理鹽水調(diào)至0.5濁度麥?zhǔn)?直接用此鹽水懸液作為接種物。無菌棉簽蘸取上述懸液,均勻涂布于9cm馬丁血清裂解血平板。待稍干后,用無菌鑷子取替米考星(T)、氟苯尼考(F)、恩諾沙星(ENO)、慶大霉素(GM)、頭孢噻呋鈉(CF)、阿莫西林(AMX)、環(huán)丙沙星(CIP)、磷霉素(FOS)、氧氟沙星(OFL)、硫酸新霉素(N)10種常用藥敏紙片(紙片直徑6.3~6.4mm)平貼在培養(yǎng)基表面,4℃放置2h使藥物擴(kuò)散,然后37℃培養(yǎng)20~24h后觀察測量抑菌圈的大小并記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)為:抑菌圈直徑<10mm為耐藥;直徑在14~16mm之間為中度敏感,直徑>16mm為敏感。1.2.3糖、葡萄糖、麥芽糖、鼠李糖、糖、鼠李糖、糖、糖、玉米糖、m、明膠將分離菌純培養(yǎng)物接種于微量糖發(fā)酵管(包括蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、乳糖、鼠李糖、甘露醇、甘露糖、MR、明膠等),37℃培養(yǎng)72h后記錄生化試驗結(jié)果(徐剛等,2012)。1.2.4引物的合成按照莢膜血清A型巴氏桿菌特異性序列設(shè)計1對擴(kuò)增16SrRNA的引物。引物序列為:s1-a:5′-TGCCAAAATCGCAGT-CAG-3′;s2-a:5′-TTGCCATCATTGTCAGTG-3′,預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1040bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。退火溫度為55℃,反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按常規(guī)進(jìn)行,對分離菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定(奎玲等,2011)。1.2.5動物疾病試驗1.2.5.人工感染途徑檢測取9只健康昆明Ⅱ系小白鼠,5只試驗組昆明Ⅱ系小白鼠腹腔接種上述懸濁液0.1mL/只(約108CFU),4只對照組昆明Ⅱ系小白鼠腹腔注射同等劑量的生理鹽水,連續(xù)觀察7d,觀察并記錄發(fā)病和死亡情況(奎玲等,2011)。1.2.5.日本大耳白兔發(fā)病條件觀察取分離菌培養(yǎng)物接種4只日本大耳白兔,靜脈注射1.0mL(約109CFU),連續(xù)觀察14d,同時設(shè)4只對照,分別注射1.0mL生理鹽水。日本大耳白兔發(fā)病的臨床標(biāo)準(zhǔn)為鼻部潮濕、有鼻炎、流膿性鼻液。觀察并記錄發(fā)病和死亡情況并逐只剖檢觀察病變。1.2.6疫苗準(zhǔn)備1.2.6.解血工藝、培養(yǎng)、冷藏將純化、鑒定后的分離菌接種含4%雞血清、1%裂解血的馬丁肉湯,高密度通氣發(fā)酵培養(yǎng),37℃培養(yǎng)12h,培養(yǎng)物加入1‰福爾馬林溶液,37℃滅活24h,無菌檢驗合格后,于4℃冷藏備用。1.2.6.2.制備疫苗1.2.7試驗2:長毛兔逐步血清試驗應(yīng)用1.2.6制備的巴氏桿菌本場疫苗進(jìn)行免疫。在養(yǎng)殖場試驗區(qū),挑出明顯消瘦及有明顯呼吸道癥狀和嚴(yán)重鼻炎的病兔,不參與試驗;有輕微鼻炎癥狀的長毛兔參與試驗,選取2300只,籠位相鄰的24月齡長毛兔進(jìn)行試驗。共設(shè)試驗A、B、C3組,分別為巴氏桿菌本場疫苗免疫試驗組、恩諾沙星防治試驗組、巴氏桿菌本場疫苗免疫與恩諾沙星聯(lián)用試驗組,另設(shè)1個對照組。試驗A、C組提前免疫,與試驗B組及對照組同時觀察至30d。死亡長毛兔逐只剖檢,觀察其肺臟病變。檢查肺臟是否有大面積出血、壞死、化膿,癥狀符合其一,確定為肺炎死亡指征。試驗A組:取600只成年長毛兔,頸部皮下注射1.0mL/(只·次),連續(xù)免疫2次,每次相隔1周,隨機(jī)選擇其中500只,自第2次免疫后第4天開始觀察,每隔2d記錄1次死亡只數(shù),連續(xù)觀察30d,記錄結(jié)果。試驗B組:取恩諾沙星,按24mg/只(一般3.5~4kg/只),隨機(jī)選擇500只成年長毛兔投喂,每天1次,連用4d,從第1天開始觀察結(jié)果,每2d記錄1次死亡情況,連續(xù)記錄30d。試驗C組:取600只成年長毛兔,頸部皮下注射1.0mL/(只·次),連續(xù)免疫2次,間隔1周,且在第2次免疫后第4天投喂恩諾沙星,按24mg/只(一般3.5~4kg/只),每天1次,連用4d。同時,自投藥后第1天隨機(jī)選擇其中500只長毛兔開始觀察,每隔2d記錄1次死亡只數(shù),連續(xù)觀察30d,記錄結(jié)果。對照組:取相鄰區(qū)域500只成年長毛兔作為對照組,不采取任何處理措施,正常飼喂,記錄觀察結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1革蘭氏陰性球桿菌的分離和鑒定在馬丁血清裂解血平板上37℃培養(yǎng)24h后,形成圓形、凸起、光滑透明、邊緣整齊、濕潤的露珠樣菌落,直徑為1~2mm。膿液和培養(yǎng)物鏡檢均發(fā)現(xiàn),該分離菌為革蘭氏陰性球桿菌,單個或成對存在;美蘭染色為兩極著色的小桿菌,膿液中細(xì)菌和培養(yǎng)物的細(xì)菌形態(tài)一致。接種麥康凱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48h,不生長。分離菌命名為sd-1株。2.2藥物敏感試驗藥敏試驗結(jié)果顯示,分離菌sd-1對替米考星(T)、恩諾沙星(ENO)、氟苯尼考(F)、慶大霉素(GM)、頭孢噻呋鈉(CF)、阿莫西林(AMX)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、磷霉素(FOS)敏感;對硫酸新霉素(N)中度敏感。其中,替米考星、恩諾沙星、氟苯尼考最為敏感,所產(chǎn)生的抑菌圈最大,達(dá)30mm以上。2.3德維護(hù)斯的分離2.3.1糖酸糖產(chǎn)酸液sd-1株的生化試驗結(jié)果見表1。由表1得知,sd-1株發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇、甘露糖、蔗糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;不發(fā)酵乳糖、麥芽糖、鼠李糖;不液化明膠,MR試驗陰性,吲哚試驗陽性,觸酶試驗陽性,硝酸鹽還原陽性,在麥康凱培養(yǎng)基上不生長,符合巴氏桿菌的生化特征,推測sd-1株為巴氏桿菌。2.3.2大小片段的估計sd-1株P(guān)CR檢測結(jié)果見圖3。由圖3可知,能得到大小為1040bp的片段,與預(yù)期結(jié)果相符。結(jié)合分離培養(yǎng)、鏡檢結(jié)果及生化試驗結(jié)果,可證實sd-1株為莢膜血清A型巴氏桿菌。2.4動物疾病試驗2.4.1攻毒臨床性狀觀察昆明Ⅱ系小白鼠致病性試驗結(jié)果見表2。由表2可知,觀察7d,sd-1株攻毒昆明Ⅱ系小白鼠5只,全部死亡,對照組4只全部健活,表明sd-1株有較強(qiáng)的致病性。2.4.2對日本大耳白兔的安全性由表3可知,sd-1株攻毒4只日本大耳白兔,2只死亡,2只發(fā)病,發(fā)病率100%,對照組4只全部健活。表明sd-1株對日本大耳白兔有一定的致病性,在短時間內(nèi),部分不死亡,但臨床癥狀明顯。剖檢死亡兔發(fā)現(xiàn),第4天死亡的兔子肺臟僅見大面積出血及少量化膿灶,第8天死亡的兔子,肺臟出現(xiàn)了化膿性肺炎。將2只存活發(fā)病兔剖檢發(fā)現(xiàn)一側(cè)肺化膿、壞死,充滿米粒大小的化膿灶,內(nèi)有奶油色膿汁,另一側(cè)肺臟少量出血。從發(fā)病及死亡兔肺臟均分離到攻毒細(xì)菌。2.5死亡率和藥物狀態(tài)長毛兔綜合防控試驗結(jié)果見表4。由表4可知,用藥30d后試驗A、B、C組以肺炎為死亡指征的死亡率分別為1.6%、2.4%、1.0%,均低于對照組(4.4%)。試驗C組的鼻炎明顯少,但試驗B組30d后鼻炎有明顯的增加,且死亡率也有明顯的回升;而試驗C組前期死亡率較低,鼻炎回升也很慢,癥狀輕微;試驗A組前期死亡率高,后期鼻炎發(fā)生率不高,癥狀很輕微。3討論3.1巴氏桿菌對日本大耳白兔致病性的影響sd-1株分離菌革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性球桿菌,單個或成對存在;美蘭染色為兩極著色。麥康凱培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24h,不生長。生化試驗結(jié)果顯示符合巴氏桿菌特點。分子生物學(xué)檢測顯示為莢膜血清A型巴氏桿菌。動物試驗結(jié)果表明,該菌有足夠的致病力引起日本大耳白兔發(fā)生化膿性肺炎而引發(fā)死亡。由此,確定此次發(fā)病由莢膜血清A型巴氏桿菌引起。巴氏桿菌可引起日本大耳白兔的鼻炎、肺炎、敗血癥、結(jié)膜炎、中耳炎、子宮睪丸炎等(王振華,2012),其多樣性在臨床上常令獸醫(yī)陷入誤診。此次巴氏桿菌病并未引起日本大耳白兔的急性死亡(敗血癥),而是引起化膿性肺炎及鼻炎癥狀,與高光明等(2010)、郭慧霞等(2010)、徐剛等(2012)報道的有所不同,據(jù)筆者觀察在日本大耳白兔所發(fā)生的巴氏桿菌病中以鼻炎、化膿性肺炎、結(jié)膜炎、中耳炎及子宮睪丸炎等癥狀的病例較多,而以敗血癥為特征的急性死亡病例在臨床實踐中并不多見。3.2分離菌sd-1的耐藥鑒定藥敏試驗結(jié)果顯示,sd-1株對替米考星(T)、恩諾沙星(ENO)、氟苯尼考(F)、慶大霉素(GM)、頭孢噻呋鈉(CF)、阿莫西林(AMX)、環(huán)丙沙星(CIP)、氧氟沙星(OFL)、磷霉素(FOS)敏感;對硫酸新霉素(N)中度敏感,也說明了分離菌sd-1株對多種藥物很敏感,應(yīng)用大部分藥物可有效控制。但此次發(fā)病,單獨藥物控制難以完全有效控制。孫寶瑩等(2004)報道兔巴氏桿菌耐藥現(xiàn)象較嚴(yán)重,多數(shù)為多重耐藥,且對青霉素類、氟苯尼考及利福平敏感性較高,建議應(yīng)用氟苯尼考治療,但敏感藥物臨床應(yīng)用是否會引發(fā)其他有害副作用,并未提及。筆者在臨床實踐中使用廣譜抗菌藥物,如利福平、氟苯尼考等,常會引發(fā)家兔腹瀉等癥狀,從而引起家兔大批死亡的病例并不少見,因此,建議在家兔臨床中慎用廣譜抗菌藥物,必須要用時,最好通過肌肉或靜脈給藥,防止發(fā)生意外。3.3試驗結(jié)果及分析試驗A和C組的死淘率分別為1.6%、1.0%,B組的死淘率為2.4%,都明顯低于對照組的死淘率4.4%,說明3種防控方法均有療效,其中以試驗C組為最好,即巴氏桿菌本場疫苗免疫和恩諾沙星聯(lián)用試驗組。試驗B組明顯不如試驗A、C組,試驗B組用完藥物30d后,新的疫情又開始了,又恢復(fù)到原來的狀態(tài)。而試驗A、C組一直保持低肺炎死亡率狀態(tài),在免疫30d后死亡的兔子肺臟中未再次分離到巴氏桿菌,說明應(yīng)用巴氏桿菌本場疫苗能有效控制莢膜血清A型巴氏桿菌病。通過防治試驗發(fā)現(xiàn)無論用疫苗免疫還是用恩諾沙星投藥,剛開始采取措施之后10d內(nèi)死亡率沒有很明顯的起色,隨著日期的延長,死亡率進(jìn)一步下降,筆者認(rèn)為,這種現(xiàn)象可能是因為很多表面健康兔已經(jīng)發(fā)病且陷入嚴(yán)重肺炎狀態(tài),但未觀察到臨床癥狀,隨著時間延長,癥狀加重而死亡。而之后死亡率降低可能是恩諾沙星起到了前期殺滅細(xì)菌,抑制了細(xì)菌的增殖。巴氏桿菌本場疫苗免疫組則是前期抗體未達(dá)到相當(dāng)高的滴度,尚